2021 Fiscal Year Research-status Report
Visualization of turnover history of membrane proteins in CNS neuron
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21K19350
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
好岡 大輔 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (00883084)
大河内 善史 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90435818)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 1分子計測 / アンキリン / ホメオスタシス / ニューロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類中枢神経のニューロンにおける軸索初節でのイオンチャネルの除去、組み込みの履歴を可視化するために新潟大学崎村研で作製したNav1.6 蛍光タンパク質ノックインマウスを阪大側で受け入れて、ヘテロマウスの飼育を進めたところ、順調に成体を得ることができた。また遺伝子組換えを誘導するためにCreリコンビナーゼを発現するAAVウィルスの調整を行った。複数の個体の脳について、GFP蛍光、およびGFP抗体を用いた免疫染色を実施した結果、明確な蛍光シグナルは検出されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Nav1.6 蛍光タンパク質ノックインマウスを順調に飼育することができたものの、固定した脳標本からGFP蛍光シグナルが検出できなかった。この点について、グリアマーカーのGFAP抗体による染色は陽性であり、脳の固定サンプル自体には問題があるとは考えられない。GFP蛍光が見られなかった理由として以下が考えられた。
（1）pgk-Neoを除いていない状態のためpgkプロモーターの影響により転写が抑制された可能性。
（2）イントロンに挿入したlox2272配列の位置が悪くスプライシングに異常が生じた可能性。
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| Strategy for Future Research Activity |
７．で記述した可能性のうち、（１）の可能性を検証するため、FLPデリーターマウスと交配させる。Creデリーターマウスとの交配でtdTomato融合Nav1.6が発現するかどうかを調べる、またはAAVによりCreリコンビナーゼを発現させてtdTomatoの蛍光を観察することにより、（2）の可能性も検証する計画である。
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| Causes of Carryover |
Nav1.6-FLExマウスにおいて、GFP蛍光が観察されなかったことから、初年度に計画していた時期特異的にCreリコンビナーゼを発現させるための、系統の掛け合わせ実験を延期する必要が生じた。またCreリコンビナーゼを発現できるAAVウィルスの作製が遅延している。そのためTetO Creマウスの入手および飼育にかかる費用、AAVウィルスの実験に必要な試薬などの消耗品経費を持ち越すことになった。今後、 FLPデリーターマウスとの掛け合わせなどによってGFP蛍光が見られるようになった場合に、TetO Creマウスの購入ならびに飼育、維持、さらにAAVウィルスの実験の推進のための経費として支出する予定である。
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