2023 Fiscal Year Annual Research Report
Development of nucleotide sequence-specific in situ detection technology for methylated DNA
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21K19354
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
北澤 荘平 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (90186239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北澤 理子 愛媛大学, 医学部附属病院, 准教授 (00273780)
原口 竜摩 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (00423690)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | メチル化シトシン / in situ hybridization / Padlock probe / PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組織切片上で、蛋白質や糖鎖などの検出には免疫組織化学が、核酸の検出にはin situ hybridization法が開発され、多くの形態学的研究や病理診断に応用されている。本研究の課題であるメチル化シトシンは、エピジェネティクス制御機構の主体をなすDNA修飾であり、その異常は様々な病態形成に関与している。本研究課題では、未だに開発されていない新たな手法の開発を行い、遺伝子の特定部位のメチル化シトシンの存在がもたらすエピジェネティクスな変化を形態で捉える手法の開発を行った。標的のメチル化シトシンに対してオスミウム酸錯体を形成し、標的DNA との間に強固な結合を形成するプローブ作製を中心に行い、メチル化部位特異的なプライマー配列と、組織切片・染色体標本上でのin situ DNA増幅法（Padlockプローブ法）の条件最適化を行った。単一遺伝子上のたった1個のメチル化シトシンの存在を、光学顕微鏡下で検出し、病理診断への応用研究を行うために、スライドガラス状にメチル化、非メチル化DNAのメチル化を固着させた後、ガラススライド上で結合反応、増幅反応を行った。細胞・組織切片上でのメチル化シトシン-標識グアニン複合体の検出（培養細胞を用いた予検討）in situ hybridizationに用いる細胞の固定条件を決定するために、種々の固定液、固定時間、固定後処理について検討し、最適化をしている。さらに、Padlock法での合成過程で伸張するDNAを直接螢光標式することにより、更なる感度の向上を図り、単一メチル化シトシン塩基の組織細胞化学的検出が出来る様になっており、対象とする遺伝子をマウスのRANK遺伝子（破骨最奥分化因子受容体）として前破骨細胞および骨芽細胞、骨細胞分化過程に於けるRANKL遺伝子のTATA-box近傍の1ヶ所のメチル化検出を行い、論文化、学会報告を行った。
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