Detection of host risk factors of SARS CoV-2 infection in exosomes and other extracellular vesicles in saliva

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19367
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 斉藤 繭子 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (20598031)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 道子 東北大学, 医学系研究科, 助教 (10593981)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2023-03-31
• Keywords: COVID-19 / SARS-CoV-2 / 感染リスク因子

Outline of Annual Research Achievements

2021年度は新型コロナウイルス感染症(COVID-19)の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のレセプターである唾液中のACE2、ウイルスのスパイク蛋白を活性化させるセリン膜貫通プロテアーゼ(TMRPSS2)の定量化を目的としてELISA法による適性化を行った。保存検体を用いて年齢・性別階層別にのACE2量の比較を行った結果、幼児においては成人に比べてACE2量が低い可能性が示唆された。また、SARS-CoV-2をヒト肺上皮腺がん細胞（Calu-3）に感染させ、細胞外小胞(EV）の回収・分離方法とその確認方法の適性化を行った。EVの回収法としては、ショ糖クッション遠心法を用いて細胞培養液からの回収を行ない、試料中に含まれる粒子の大きさと形状をナノ粒子軌跡解析、電子顕微鏡像にて確認した。さらにEVに特徴的なマーカーとされるAlix, CD9、HSP70をウェスタンブロット法で確認した。これらの結果が国際細胞外小胞学会が推奨するEV回収の確認基準を満たしたことから、Calu-3感染細胞由来のEVが分離されたと判断した。また、この分画から抽出したRNAにSARS-CoV-2遺伝子の一領域が、培養上清や超遠心後の上清に比べて高い濃度で含まれていることを定量PCR法で確認した。これにより、ヒト細胞由来のEV内にSARS-CoV-2関連物質が含まれる可能性が示唆されたが、さらなる検証の反復が必要な状況である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

感染細胞を用いた細胞外小胞(EV)の分離方法についてはプロトコールがほぼ確立したものの、十分な実験の反復に至らず、結果を発表するに至っていない。2021年に予定していた臨床検体からのEV検出は試験的に行なったのみで本研究に必要な結果は得られていない。

Strategy for Future Research Activity

感染細胞および臨床検体からの細胞外小胞(EV)の分離方法の改善、電子顕微鏡像によるEVと新型コロナウイルス(SARS CoV-2)の判別方法の検討を継続する必要がある。EVとSARS CoV-2が回収・分離された試料中に混在する場合、それらの判別がこれまでの電顕像では不鮮明であったことが課題として上げられる。ウイルスのスパイクタンパクを染色することなどにより画像上の判別方法を改善する必要がある。

Causes of Carryover

前年度に予定していた基礎実験が、新型コロナウイルスの変異株流行に伴う研究業務の遅滞や制限、新型コロナウイルス取り扱いに関する実験施設の使用許可申請による実験の地帯等により基礎研究に関わる試薬代、臨床研究にかかわる人件費等が施行されなかった。2021年度の残額については2022年には細胞外小胞の検出実験を継続、発展させるために必要な試薬と人件費、機材等の施設利用料、検体収集材料、検体輸送費に使用する予定である。