2021 Fiscal Year Research-status Report
Hologenome transcriptomic analysis to underastand the molecular basis of tick-bacteria symbiosis
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21K19381
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
林 哲也 九州大学, 医学研究院, 教授 (10173014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田仲 哲也 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (00322842)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | ホロゲノム / トランスクリプトーム / ダニ / 細菌 / 共生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リケッチアは経卵感染が可能なためマダニと緊密な共生関係にあるが、その相互作用は明らかになっていない。紅斑熱リケッチアのホスト/ベクターであるフタトゲチマダニH. longicornis (LON)には両性生殖系と単為生殖系が存在し、多くの両性系株にはR. longicornii (Rlon)が存在し、経卵感染で安定に維持されている。本研究では10年以上にわたって継代されているLONの飼育系を利用して、Rlon保有系と非保有系を確立し、Rlon共生によるマダニの特性変化を解析するとともに、発育ステージの進行に沿ったホロトランスクリプトーム解析を行い、マダニでのリケッチア遺伝子の発現と各ステージおけるマダニ遺伝子の発現を解析し、LONとRlonの共生関係の実態と関連遺伝子群の同定すること、さらにこれをモデル系としてマダニと病原体の共生関係の実態解明という研究分野の開拓を目指す。本年度は、技術基盤となる２項目に関して解析を進めた。
1. Rlon保有系統の確立：Rlonの両性・単為生殖系LONへの感染実験を行い、接種検体の調整法の違いによるRlonの感染効率と安定性を検討した。具体的には、３通りの方法で調整したRlon検体を血体腔接種によりLON個体に接種し、LON個体内のRlonコピー数をqPCRにより解析した。現在、再現性の確認を行なっている所であるが、少なくとも4週間後までは、Rlonが両系統に保持されることを確認でき、最も効率の良い接種検体調整法を決定した。
2. ホロゲノムトランスクリプトーム解析系の確立：鍵となるのはrRNAの除去であるため、まず最近利用可能となったQIAseq社のキットを用いて、マウスと細菌（サンプル調整の問題から別菌種を使用）の混合検体からのrRNA除去効率を検討し、マウス培養細胞への感染実験（コントロール実験）に対しては対応可能であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
R. longicornii（Rlon）保有フタトゲチマダニ(LON)の確立については、培養したRlonの両性および単為生殖系LONへの感染実験により、少なくとも4週間後まではRlonが両系統に保持されることを確認でき、最も効率の高い接種検体の調整法を決定できた。しかし、COVID-19によって大学間での人の行き来が制限されたことなどから、感染実験の開始が遅れ、さらにマダニを分担者から送付してもらって解析を行う必要が生じたため、Rlon保有マダニが経卵感染によって安定に維持されることをウサギへのダニ感染実験によって確認するまでには至らなかった。ホロゲノムトランスクリプトーム解析系の確立については、解析の鍵となるrRNAの除去に関して、QIAseq FastSelect Epidemiology Kitsを用いてマウスと細菌のrRNAを同時に除去できることを確認できた。しかし、独自に作成する必要のあるマダニのrRNA除去法は、当初予定していたNEB社のシステムが使えなくなったため、別のシステムの利用を検討することになり、現在はQIAGEN社のシステムを用いることを検討している段階にある。以上の理由のため、Rlon陽性ダニ個体の予備的ホロトランスクリプトーム解析によるrRNA除去効率の確認と解析に必要なデータ量を検討するまでには至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目の前半は項目1, 2に関連した解析を進め技術基盤を確立する。【項目１】Rlonの両性・単為生殖系フタトゲチマダニ(LON)でのRlon保有マダニ作出とウサギへのダニ感染実験により、経卵感染で安定に維持されるRlon保有系統の作成を試み、両系統のLONでRlon保有系統が成立するか否かを明らかにする。【項目2】QIAGENのシステムを利用してマダニ用のrRNAの除去系を作成する。これを用いてRlon陽性ダニ個体の予備的トランスクリプトーム解析を実施し、除去効率の確認と解析に必要なデータ量を検討することでホロトランスクリプトーム解析系を確立する。
2年目の後半からは、以下の2項目を実施し、LONとRlonの共生関係の実態解明と共生に関連する遺伝子群の同定を目指す。【項目3】Rlon保有/非保有系統の吸血行動、産卵と孵化効率、垂直感染（経卵感染）の効率を比較解析することにより、Rlonが共生した場合のLONの特性変化を明らかにする。【項目4】各発育ステージのダニ個体（Rlon保有/非保有系統）を用いてRNA-seq解析を行い、LONおよびRlonの参照配列へのリードマッピングにより、各ステージ（幼ダニ・若ダニ・成ダニの３ステージと各ステージでの吸血前後のサンプル）のLONおよびRlonの遺伝子発現を網羅的にモニターする。対照としてRlonが感染したマウス由来L939細胞を解析する。LONに関しては、タイムポイント間でのダニ発現遺伝子の違い（ステージ特異的発現遺伝子の同定）とリケッチア共生の有無による発現遺伝子の違い、Rlonに関しては、ダニ内で発現しているリケッチア遺伝子の同定、タイムポイント間での発現量変化（ステージ特異的遺伝子発現）、哺乳類細胞（マウス由来の培養細胞）での発現パターンとの違いを明らかにし、共生に関わるマダニとリケッチアの機能とその責任遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
R. longicornii（Rlon）保有マダニの確立については、Rlonの両性および単為生殖系マダニへの感染実験により、少なくとも4週間後まではRlonが両系統に保持されることを確認でき、最も効率の高い接種検体の調整法を決定できた。しかし、COVID-19によって大学間での人の行き来が制限されたことなどから、感染実験の開始が遅れ、さらにマダニを分担者から送付してもらって解析を行う必要が生じたため、経卵感染によって安定に維持されるRlon保有マダニの確立までには至らなかった。また、ホロトランスクリプトーム解析系の確立についても、解析の鍵となるrRNAの除去に関して、QIAseq FastSelect Epidemiology Kitsを用いてマウスと細菌のrRNAを同時に除去できることを確認できたが、独自に作成する必要のあるマダニのrRNA除去法は、当初予定していたシステムが販売中止となった。そのため別のシステムの利用を検討することになり、現在は他社のシステムを用いることを検討している段階にある。これらの理由により、Rlon陽性ダニ個体の予備的ホロトランスクリプトーム解析によるrRNA除去効率の確認と解析に必要なデータ量の検討が年度内には実施できなかったため、その費用を次年度に繰越し、この解析を次年度に実施したい。
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Research Products
(4 results)
