2021 Fiscal Year Research-status Report
正常―がん細胞間作用に基づくがん防御機構の化学生物学的解析
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21K19418
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
仙波 憲太郎 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (70206663)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 信元 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, ユニットリーダー (90221689)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | がん / ケミカルスクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞のまわりを取り囲む正常細胞は、がん細胞の増殖とその領域拡大を抑制する機能が備わっている。しかし、この機能が破綻もしくは減弱すると、がん細胞は正常な組織を破壊しながら増殖を続け、腫瘍を形成するようになる。我々は、KRAS発現細胞（がん細胞モデル）と正常細胞との混合培養系を用いて、正常細胞のもつこの機能を強化する化合物のスクリーニングを行った。その結果、構造も既知活性も異なる3つのヒット化合物（α、β、γ）を獲得した。2021年度は、(1)ヒット化合物の標的タンパク質のアフィニティー精製及び質量分析による同定、(2)ヒット化合物添加時の正常細胞・KRAS発現細胞での発現変動遺伝子の解析、(3)ヒトがん細胞株を用いたヒット化合物への感受性評価を行なった。(1)について、化合物αの20種類の類縁体の評価を行い、ある程度の構造活性相関を得ることができた。現時点で抗がん作用との関連が期待される標的タンパク質の同定には至っていないが、類縁体の解析で得られた知見も活用しながら、引き続き質量分析のシステムを変えて検討を進めている。 (2)について、ヒット化合物（α・β）を添加した際に正常細胞側で特異的に変動する遺伝子群を同定することができた。また、ウエスタンブロッティングによるシグナル伝達経路の解析から、化合物α・βで処理した際に正常細胞内で特異的に活性が変化するシグナル関連タンパク質を見出した。(3)について、26種のヒトがん細胞株を用いて、ヒット化合物（α・β）がもたらす抗がん活性を検討した結果、化合物への感受性を指標に細胞株を分類することができた。そのうち９種の細胞について詳細に検討したところ、各細胞が示す化合物α・βへの感受性には相関があることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度は、ヒット化合物の活性との関連が示唆される複数の現象を見出すことができた。まず、発現変動遺伝子の解析からは、それぞれのヒット化合物は全く異なる用途・標的を持つことが報告されてきた化合物であるにも関わらず、各化合物を添加した際に共通して、正常細胞内で変動する遺伝子群を同定することができた。エンリッチメント解析の結果、これら発現変動遺伝子は特定の細胞機能に関与することが明らかになった。さらに、その発現変動はKRAS発現細胞内では確認されなかったことから、化合物処理によって正常細胞の性質が変化することが、ヒット化合物が持つ抗がん作用において重要である可能性が示唆された。
遺伝子発現解析と並行して、多数のシグナル関連タンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、化合物が制御するシグナル経路を探索した。その結果、正常細胞側で化合物添加時に特異的にタンパク質Xのリン酸化が低下することを見出した。さらに、ヒット化合物の類縁化合物を用いて評価した結果、タンパク質Xのリン酸化が、化合物が持つ抗がん作用の有無と相関する可能性が示された。
また、化合物α、βに対する感受性によりヒトがん細胞株を分類することができた。さらに、αに対する感受性とβに対する感受性には相関があることも示された。異なる遺伝子発現のバックグラウンドを持つがん細胞株を、感受性の有無を指標に分類して解析することによって、化合物α、βが抗がん作用を発揮する際に必要な条件を見出すことにつながることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度の作用機序解析を踏まえ、ヒット化合物の作用機序を明らかにするために、前年度から引き続き、(1)アフィニティー精製によるヒット化合物の標的タンパク質の同定と、(2) 発現変動遺伝子のノックダウン及び強制発現による現象への関与の検討、(3)感受性の有無で分類したヒトがん細胞株の遺伝子発現解析を行なう。
(1) 現時点で標的タンパク質が得られていないことから、アフィニティー精製のこれまでの手法を一部変えて試みる。具体的には、ヒット化合物を共有結合させたアフィニティー担体にタンパク質を結合させたのち、ヒット化合物の添加によって競合的に溶出させ、標的タンパク質の同定を進める。質量分析の手法についてもダイレクトショットガン解析法などに変えて検討する予定である。
(2) 発現変動遺伝子解析については、現時点で細胞内での発現量や化合物添加による発現変動の大きさ、個々のタンパク質の機能などの面から候補とする遺伝子の抽出は完了しており、今後、正常細胞への候補遺伝子の強制発現やノックダウン実験を進め、抗がん活性との関与を明らかにしていく。
(3) ヒトがん細胞株を用いた解析については、感受性の有無を指標に細胞株を2群に分類することによって進める。具体的には、共通する遺伝子発現のパターンは存在するのか、もしくは、化合物を添加した際に特異的に発現が変動する遺伝子に共通するものが存在するかについて着目して解析する。また、効果が認められる細胞株については、in vivoの造腫瘍実験系を確立し、治療実験を行いたい。以上の解析を通じて感受性を規定する因子を明らかにするとともに、ヒット化合物の作用機序解明への糸口を得たい。
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| Causes of Carryover |
21年度も新型コロナウイルスの感染対策のため、研究室の三密を避けながらの研究活動だったこと、想定していたRNAseq解析や動物実験が次年度に持ち越されたこと、がその原因として考えられる。22年度の使用計画として、これらの実験に加え、質量分析に使用する予定である。また、勤務外での学会発表のため、旅費の支出が見込まれる。
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Research Products
(1 results)
