Development of gene-based therapeutic approach for Down syndrome using novel genome editing technology

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19448
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 北畠 康司 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80506494)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2025-03-31
• Keywords: ダウン症候群 / iPS細胞 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群では、21番染色体トリソミーにより重篤な知的障害と認知障害が起こる。我々はダウン症候群のアストロサイトではNLRP3インフラマソームの活性が亢進し、神経細胞に強い変性細胞死をもたらし、かつその原因遺伝子がDYRK1Aであることを明らかにした。本研究ではそのコピー数を正確に修正するために、新規のゲノム編集技術CRISPR-Cas3に注目し、アレル特異的SNPを用いてDYRK1Aのアレル選択的コピー数修正を行うことを目指している。昨年度までの研究により、DYRK1Aの3つのアレルのうち1つだけに存在するSNPを見出し、このアレル特異的SNPを含んだguide RNAを作製してCRISPR-Cas3を作用させてみたところ、iPS細胞においてDYRK1Aのゲノム量が減少することを確認することができた。さらにiPS細胞から分化誘導したアストロサイトにおいても、CRISPR-Cas3によって正確なゲノム量減少を確認することができた。今年度はこのゲノム編集を加えたアストロサイトをもちいて解析を行った。DYRK1Aの遺伝子量が補正されたアストロサイトではDYRK1Aの発現量が低下し、アストロサイトの異常な増殖亢進作用が正常化していた。さらにNLRP3の発現量低下とNLRP3インフラマソームがもたらす炎症応答の減弱も確認することができた。重要なことに、アストロサイトと共培養した神経細胞において、そのアポトーシスも抑制されることが分かった。このことは、CRISPR-Cas3とアレル特異的SNPの組み合わせによる遺伝子量補正が有効であること、そしてダウン症におけるDYRK1Aのコピー数補正が病態改善に繋がる可能性があることを示している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

アストロサイトにアレル特異的SNPとCRISPR-Cas3を組み合わせることによって、ダウン症アストロサイトの持つ異常な表現型が改善されることを示すことができ、さらにそのアストロサイトと神経細胞の共培養によって、神経アポトーシスを抑制することができた。このことはこのアレル特異的ゲノム編集による遺伝子治療法が有効である可能性を示すであろう。

Strategy for Future Research Activity

今後はin vivoでの検証が必須となり、そのためにも神経系への核酸送達が可能となるドラッグデリバリーシステムの開発が重要となるが、アデノ随伴ベクターではCRISPR-Cas3が搭載できないことが分かってきた。そこで脂質ナノ粒子の開発を進めていきたい。

Causes of Carryover

動物実験施設におけるマウスの導入に時間がかかったため、本年度中にマウスへの打ち込み実験と解析を進めることができなかった。したがって次年度へと研究費を繰り越すこととなった。