2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of morphogenesis, maintenance and stabilization, and maintenance mechanism of glomerular podocytes by microtubule bundles
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21K19484
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
竹居 孝二 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (40322226)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | ポドサイト / ダイナミン / 微小管 / チューブリン / 生体 / アクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）ダイナミン１の微小管制御機構解明のため、精製タンパクを用いて微小管束形成を蛍光顕微鏡観察した。微小管の束化は全長ダイナミンだけでなくダイナミン１のプレクストリン相同（PH）ドメインでも観られた。さらに、ダイナミン１のPHドメイン、プロリンリッチ（PR）ドメインに対応する合成ドデカペプチドを用いた結合阻害実験により、PHドメインに存在する微小管結合部位を特定した。
２）ダイナミン１が微小管依存性の細胞内小胞輸送に及ぼす影響を細胞レベルで解析した。血清刺激によりラッフル形成させた肺癌H1299細胞をモデル細胞として、カルシウムチャンネルTRPV2のラッフル膜への輸送を蛍光免疫染色とカルシウムイオンの細胞内流入を指標に調べた。ダイナミン1をノックダウン細胞では微小管束が減少しTRPV2のラッフル膜への移行が減少したことから、ダイナミンに1による微小管制御は微小管依存性の細胞内小胞輸送に必要であると考えられた。
３）ポドサイトは分化に伴い著しく伸展することから、アクチンのリモデリングと細胞膜ダイナミクスを連携させる機構が存在すると考えられる。この連携を担う分子としてダイナミン２の関与が予想されたので、野生型ダイナミン２および疾患変異K562Eを用いてポドサイトにおける機能を調べた。K562E発現ポドサイトではストレスファイバーが減少し、異常なアクチンクラスターが形成され、ストレスファイバー再形成能も低かった。精製タンパクを用いた解析では、K562Eのアクチン線維束化能は野生型より少なく、膜結合能、膜変形能、自己重合能は顕著に低かった。リポゾームと野生型ダイナミン２存在下では、アクチン線維は太い線維束を形成されたが、K562Eではその形成は少なかった。以上より、ダイナミン２の脂質膜に対する親和性と自己重合能がポドサイトにおけるアクチン束化に必要であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ダイナミン１による微小管制御（上述研究実績１、２）については、第62回日本生化学会中国・四国支部例会、第6回日ポドサイト研究会で発表したほか、神経細胞におけるダイナミン１―微小管制御の解明に関する共同研究を高橋智幸博士（沖縄科学技術大学院大学 OIST）と開始し、成果を論文として発表した(Hori et al. Elife 2022)。この共同実験を通して、ダイナミン―微小管の結合、微小管束化の観察、合成ペプチドによる結合阻害、結合部位の特定するための基本的解析方法が確立されてきた。
ダイナミン２によるアクチンのリモデリングと細胞膜ダイナミクスの連携機構（上述研究実績３）については、第62回日本生化学会中国・四国支部例会、第6回ポドサイト研究会で発表するとともに論文としてとして発表した(Hamasaki et al. Frontiers in Cell and Developmental Biology,in press)。ダイナミンによるアクチン線維の束化―分散や、細胞膜ダイナミクス制御についても、それぞれの解析、定量化がルーティンでできるようになり、それらを同時に解析する手法も確立された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策
１．微小管束の構造と形成機構：微小管周囲に重合したダイナミン１の立体構造を明らかにするため、吉川教授（東京大）との共同研究により着手しているクライオトモグラフィー電子顕微鏡による構造解析をすすめる。解析のために、現在使用中の全長ダイナミン１に加えて、PRD 欠損変異を新規に発現精製する。
２．細胞膜伸展機構： 全反射顕微鏡によりin vitroアクチン線維形成、動態を精査する系を確立し、リポソーム（人工脂質膜）添加による動体変化を明らかにする。この観察系を応用して、ダイナミン-微小管束による膜伸展機構を観察、解析する。
３．ポドサイトにおける微小管依存性の小胞輸送機構の解明：H1299細胞で得られた、ダイナミンが微小管依存性にカルシウムチャンネルTRPV2の輸送に寄与するという知見を、培養ポドサイトを用いて検証し、成果を論文にまとめる。
４．新規の微小管束制御分子を同定する：微小管束形成を促進し、分化ポドサイトを安定化する新規分子を同定するために、ポドサイトから微小管束を単離し、質量分析により結合分子を網羅的に探索する。候補分子について、ポドサイトの安定化、微小管束形成・維持に対する影響、チューブリンやダイナミンへの結合性を調べ、機能を解析する。
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| Causes of Carryover |
消耗品納入時期の都合により、年度繰越した。
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[Journal Article] Microtubule assembly by tau impairs endocytosis and neurotransmission via dynamin sequestration in Alzheimer's disease synapse model2022
Author(s)
Hori, T., Eguchi, K., Wang, H.Y., Miyasaka, T., Guillaud, L., Taoufiq, Z., Mahapatra, S., Yamada, H., Takei, K., Takahashi, T.
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Journal Title
Elife
Volume: 11
Pages: e73542
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The lipid-binding defective dynamin 2 mutant in Charcot-Marie-Tooth disease impairs proper actin bundling and actin organization in glomerular podocytes2022
Author(s)
Hamasaki, E., Wakita, N., Yasuoka H., Nagaoka, H., Morita, M., Takashim, E., Uchihashi, T., Takeda, T., Abe, T., Saleem, M.A., Ogo, N., Asai, A., Narita, A., Kohji Takei, K.,Yamada, H.
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Journal Title
Frontiers in Cell and Developmental Biology
Volume: -
Pages: -
Peer Reviewed / Open Access
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