2021 Fiscal Year Research-status Report
Verification of gene-edited pig production method from Japan
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21K19527
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 晃 大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | Hanganutziu-Deicher抗原 / CMAH / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、世界中でドナー不足が深刻な問題となっている。一方、バイオ人工臓器（異種移植）の開発に関しては素晴らしいものがある。昨年ブタの腎移植が２例、そして今年ブタ心移植がアメリカで行われ60日生着した。これらは遺伝子を改変したブタからの臓器移植で、すでに10個の遺伝子が改変されている。また、内４つの遺伝子がknockout (KO)されている。このKO法の開発は、かつての相同組み替え法では困難を極めたが、幸い10年前より新法(ZFN法、TALEN法、CRISPR法)によるKO法が我々も含めブタでも成功している。
しかし、各国の多くのチームが使っているCRISPR/Cas9法のブタへの応用は進んでいるが、“特許”の問題が大きく絡んでいる。今回、我々のチームとしてはこれ以外の方法、つまり新規・国産のCRISPR/Cas3法を応用して、遺伝子編集ブタの作出を進めることを目的とする。
Cas３法で、比較的検定しやすいHanganutziu-Deicher抗原の遺伝子Cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase(CMAH)に対してKOを試みている。
Exon7及びExon8をターゲットにExon7の5’、Exon8の3’側にsiteを設定し、pBS-U6-crRNAを作出した（#52と#64）。 現在、そのKO効率の検定を試みている。（6x105個の）ブタ線維芽細胞に、pX-Cascade,BPNLS-hCas3,pBS-U6-crRNAをそれぞれ0.5ul導入する方法をとり、コロニーを作出し、Sequenceでdelを確認する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CRISPR/Cas3法のブタ細胞での困難性。遺伝子導入した結果として、小さなdelしか出来ないCas9法に比して、Cas3法では、多くの場合約300bp以上のdelが発生し、細胞の核に対してダメージを与え、それに伴いアポトーシスを誘導し、結果的にKO細胞のcloningの効率が落ちていることが考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas3法を継続し、他の遺伝子、例えば、成長ホルモンのレセプター（GHR）のKOにも挑戦する。
また、新しいKO法、例えばCas12a(Cpf1)の場合はcrRNA が41-44bpでありオフターゲット効果が少ない事になるが、PAM siteがTTTVと特殊で、切断効率はCas9より落ちるとされている。この様な方法も取り入れて、総合的に新しいKO法に取り組んでいく。
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| Causes of Carryover |
2021年度の挑戦的萌芽採択月が7月であり、先に採択された他の研究プロジェクトが遂行していたため。
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Research Products
(8 results)
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[Presentation] T Human CD177 suppresses the neutrophil-mediated xenocytotoxicity2021
Author(s)
Tomohisa Yoneyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Chiyoshi Toyama, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Chizu Okamatu, Yuko Tazuke, Takehisa Ueno, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
Organizer
CAST 2021
Int'l Joint Research
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[Presentation] T A membrane-type surfactant protein A (SP-A) suppresses macrophage-mediated cytotoxicity in swine endothelial cells2021
Author(s)
Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Kazuki Sato, Chizu Okamatsu, Hiroshi Eguchi, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Takehisa Ueno, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
Organizer
CAST 2021
Int'l Joint Research
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[Presentation] Testing the CPISPR / Cas3 system for the xenotransplantation field.2021
Author(s)
Shuji Miyagawa, Masahito Watanabe, Kazuki Sato, Shuhei Kogata, Chiyoshi Toyama, Kazunori Masahata, Masahumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Akira Maeda, Kazuto Yoshimi, Tomoji Mashimo, Hiroomi Okuyama, Hiroshi Nagashima
Organizer
CAST 2021
Int'l Joint Research
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[Presentation] CPISPR / Cas3 system for pig Gal-T (GGTA12021
Author(s)
Shuji Miyagawa, Masahito Watanabe, Kazuki Sato, Shuhei Kogata, Chiyoshi Toyama, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Akira Maeda, Kazuto Yoshimi, Tomoji Mashimo, Hiroomi Okuyama, Hiroshi Nagashima
Organizer
The 16th International Xenotransplantation Association
Int'l Joint Research
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[Presentation] Human CD177 Suppress Macrophage-Mediated Xenogeneic Rejection2021
Author(s)
Shuhei Kogata, Akira Maeda, Pei-Chi Lo, Chizu Okamatsu, Kazuki Sato, Riho Yamamoto, Tomohisa Yoneyama, Chiyoshi Toyama, Hiroshi Eguchi, Yuko Tazuke, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
Organizer
The 16th International Xenotransplantation Association
Int'l Joint Research
