Verification of gene-edited pig production method from Japan

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19527
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 晃 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: GGTA1 / CMAH / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

異種移植の開発に国産のCRISPR/Cas3法を検討している。既にCas9法でknockout(KO)経験のあるブタCMAHやb4GalNT2のKOと比較しながら、GalT(GGTA1)のKOをCas3法で進めた。まず、ブタでのgenome情報をもとにcrRNAをGGTA1の機能ドメインであるexon 9の上下に置いた（crRNA=#45と#86）。
次に、４群、①群Control (No Cascade)、②群 Cascade+Cas3+#45、③群 Cascade+Cas3+#86、④群 Cascade+Cas3+#45+#86を置いた。＜Cascade:pX-puro/Cascade (=bpNLS-Cascade)、Cas3:BPNLS-hCas3、crRNA=45:pBS-U6-crRNA=45、crRNA=86:pBS-U6-crRNA=86 ＞
これらをブタ線維芽細胞に遺伝子導入を行い、４８時間後の細胞を回収し、GSIB4を使ったFACS解析、およびゲノム抽出PCRにて解析した。
FACSの結果としては、欠損は②群、④群で多くみられた。遺伝子変異に関しては、④群で一番多く認めた。より大きなサイズの変異はこの方法では確認できなかったが、CRISPR/Cas3によるKOでブタ線維芽細胞において確かな変異（del:294 – 754bp）が確認できた。
次に、この④群 のCas3と#45-crRNA及び#8-crRNAをそれぞれpCXNに組み、pCXN/Cas3+#45-crRNA及びpCXN/Cas3+#45-crRNを作成し、これらを用いて、今度はブタ血管内皮細胞(SEC)に遺伝子導入を行い、SEC/GGTA1-KOの作出を試みた。同時にpCXN-GFPを導入し遺伝子効率を考慮しながら、再三に渡って試みるも、slectionに難渋しcloneの確立には至ってはいない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度と同じになるが、CRISPR/Cas3法のブタ細胞での困難性。遺伝子導入した結果として、小さなdelしか出来ないCas9法に比して、Cas3法では、多くの場合約300bp以上のdelが発生しており、細胞の核に対してもダメージを与えていることが考えられる。

Strategy for Future Research Activity

CRISPR/Cas3法を継続し、ブタ細胞を使ってGGTA1遺伝子のKO細胞等を作出する。ブタ内在性レトロウイルス(PERV)を含む、他の遺伝子にも挑戦する。

Research Products

• [Journal Article] A study of the mechanisms responsible for the action of new immunosuppressants and their effects on rat small intestinal transplantation. (2022)
  • Author(s): 著者名 Miyagawa S, Kodama T, Matsuura R, Lo PC, Sakai R, Toyama C, Takama Y, Ihara Y, Kakuta Y, Yamanaka K, Matsunami K, Eguchi H, Maeda A, Okuyama H.
  • Journal Title: Transpl Immunol. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.trim.2021.101497.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Immunosuppressive effect of a C5a receptor antagonist via macrophage regulation of an intestinal transplant in a rat model (2022)
  • Author(s): Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Takehisa Ueno, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • Journal Title: Transpl Immunol. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.trim.2022.101559
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The innate cellular immune response in xenotransplantation, (2022)
  • Author(s): Akira Maeda, Shuhei Kogata, Chiyoshi Toyama, Pei-Chi Lo, Chizu Okamatsu, Riho Yamamoto, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Masahito Watanabe, Hiroshi Nagashima, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa,
  • Journal Title: Frontiers in Immunol Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.858604.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Complement regulation in the Triple-KO era, (2022)
  • Author(s): Miyagawa S, Maeda A, Toyama C, Kogata S, Okamatsu C, Yamamoto R, Masahata K, Kamiyama M, Eguchi H, Watanabe M, Nagashima H, Ikawa M, Matsunami K, Okuyama H.
  • Journal Title: Frontiers in Immunol Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.860165.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppression of macrophage-mediated xenogeneic rejection by the ectopic expression of human CD177. (2022)
  • Author(s): Kogata S, Lo PC, Maeda A, Okamatsu C, Sato K, Yamamoto R, Haneda T, Yoneyama T, Toyama C, Eguchi H, Masahata K, Kamiyama M, Okuyama H, Miyagawa S.
  • Journal Title: Transpl Immunol. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.trim.2022.101663.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppression of xenogeneic innate immune response by a membrane-type human surfactant protein-A. (2022)
  • Author(s): Toyama C, Maeda A, Kogata S, Yamamoto R, Masahata K, Ueno T, Kamiyama M, Tazuke Y, Eguchi H, Okuyama H, Miyagawa S.
  • Journal Title: Exp Ther Med. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.3892/etm.2022.11527.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The suppression of macrophage-mediated intestinal transplant rejection by C5a receptor antagonist. (2022)
  • Author(s): Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Takehisa Ueno, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • Organizer: The Transplantation Society 2022
• [Presentation] Effect of a C5a receptor antagonist on macrophage function in an intestinal transplant rat model (2022)
  • Author(s): Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Takehisa Ueno, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • Organizer: The Transplantation Society 2022
• [Presentation] Macrophages in xenotransplantation (2022)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Takuji Kawamura, Hiroomi Okuyama, and Akira Maeda
  • Organizer: ATW 2022
• [Book] 異種移植の現状。「異種移植の現状と展望」 医学のあゆみ、vol283 no.4 (2022)
  • Author(s): 宮川周士
  • Total Pages: 3
  • Publisher: 医歯薬出版株式会社
• [Book] 移植と補体。「補体と疾患」 (2022)
  • Author(s): 宮川周士
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 日本臨床