2022 Fiscal Year Research-status Report
Verification of gene-edited pig production method from Japan
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21K19527
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 晃 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | GGTA1 / CMAH / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
異種移植の開発に国産のCRISPR/Cas3法を検討している。既にCas9法でknockout(KO)経験のあるブタCMAHやb4GalNT2のKOと比較しながら、GalT(GGTA1)のKOをCas3法で進めた。まず、ブタでのgenome情報をもとにcrRNAをGGTA1の機能ドメインであるexon 9の上下に置いた（crRNA=#45と#86）。
次に、４群、①群Control (No Cascade)、②群 Cascade+Cas3+#45、③群 Cascade+Cas3+#86、④群 Cascade+Cas3+#45+#86を置いた。＜Cascade:pX-puro/Cascade (=bpNLS-Cascade)、Cas3:BPNLS-hCas3、crRNA=45:pBS-U6-crRNA=45、crRNA=86:pBS-U6-crRNA=86 ＞
これらをブタ線維芽細胞に遺伝子導入を行い、４８時間後の細胞を回収し、GSIB4を使ったFACS解析、およびゲノム抽出PCRにて解析した。
FACSの結果としては、欠損は②群、④群で多くみられた。遺伝子変異に関しては、④群で一番多く認めた。より大きなサイズの変異はこの方法では確認できなかったが、CRISPR/Cas3によるKOでブタ線維芽細胞において確かな変異（del:294 – 754bp）が確認できた。
次に、この④群 のCas3と#45-crRNA及び#8-crRNAをそれぞれpCXNに組み、pCXN/Cas3+#45-crRNA及びpCXN/Cas3+#45-crRNを作成し、これらを用いて、今度はブタ血管内皮細胞(SEC)に遺伝子導入を行い、SEC/GGTA1-KOの作出を試みた。同時にpCXN-GFPを導入し遺伝子効率を考慮しながら、再三に渡って試みるも、slectionに難渋しcloneの確立には至ってはいない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度と同じになるが、CRISPR/Cas3法のブタ細胞での困難性。遺伝子導入した結果として、小さなdelしか出来ないCas9法に比して、Cas3法では、多くの場合約300bp以上のdelが発生しており、細胞の核に対してもダメージを与えていることが考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas3法を継続し、ブタ細胞を使ってGGTA1遺伝子のKO細胞等を作出する。ブタ内在性レトロウイルス(PERV)を含む、他の遺伝子にも挑戦する。
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[Journal Article] A study of the mechanisms responsible for the action of new immunosuppressants and their effects on rat small intestinal transplantation.2022
Author(s)
著者名 Miyagawa S, Kodama T, Matsuura R, Lo PC, Sakai R, Toyama C, Takama Y, Ihara Y, Kakuta Y, Yamanaka K, Matsunami K, Eguchi H, Maeda A, Okuyama H.
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Journal Title
Transpl Immunol.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Immunosuppressive effect of a C5a receptor antagonist via macrophage regulation of an intestinal transplant in a rat model2022
Author(s)
Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Takehisa Ueno, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
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Journal Title
Transpl Immunol.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The innate cellular immune response in xenotransplantation,2022
Author(s)
Akira Maeda, Shuhei Kogata, Chiyoshi Toyama, Pei-Chi Lo, Chizu Okamatsu, Riho Yamamoto, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Masahito Watanabe, Hiroshi Nagashima, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa,
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Journal Title
Frontiers in Immunol
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Complement regulation in the Triple-KO era,2022
Author(s)
Miyagawa S, Maeda A, Toyama C, Kogata S, Okamatsu C, Yamamoto R, Masahata K, Kamiyama M, Eguchi H, Watanabe M, Nagashima H, Ikawa M, Matsunami K, Okuyama H.
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Journal Title
Frontiers in Immunol
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Suppression of macrophage-mediated xenogeneic rejection by the ectopic expression of human CD177.2022
Author(s)
Kogata S, Lo PC, Maeda A, Okamatsu C, Sato K, Yamamoto R, Haneda T, Yoneyama T, Toyama C, Eguchi H, Masahata K, Kamiyama M, Okuyama H, Miyagawa S.
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Journal Title
Transpl Immunol.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Suppression of xenogeneic innate immune response by a membrane-type human surfactant protein-A.2022
Author(s)
Toyama C, Maeda A, Kogata S, Yamamoto R, Masahata K, Ueno T, Kamiyama M, Tazuke Y, Eguchi H, Okuyama H, Miyagawa S.
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Journal Title
Exp Ther Med.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] The suppression of macrophage-mediated intestinal transplant rejection by C5a receptor antagonist.2022
Author(s)
Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Takehisa Ueno, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
Organizer
The Transplantation Society 2022
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[Presentation] Effect of a C5a receptor antagonist on macrophage function in an intestinal transplant rat model2022
Author(s)
Chiyoshi Toyama, Akira Maeda, Shuhei Kogata, Koki Takase, Tasuku Kodama, Kazunori Masahata, Takehisa Ueno, Masafumi Kamiyama, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunami, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
Organizer
The Transplantation Society 2022
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