Verification of gene-edited pig production method from Japan

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K19527
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 晃 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00319708)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: PERV / GGTA1 / CRISPR/Cas3 / ブタ線維芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

異種移植の開発に関して各国のチームが使っているCRISPR/Cas9法のブタへの応用は進んでいるが、“特許”の問題が大きく絡んでいる。我々は、国産のCRISPR/Cas3法を応用して、PERVのKOを検討した。
まず、COSMID:CRISPR Search、susScr3を利用し、mismatch, insertion and/or defictを検討しながら、特にA /Cキメラの場合５’側にPERV-Aが来る事を考慮し、PERV-Cのenvの３‘側にcrRNA のsiteを決定した。そして、U6-crRNAを作成した。
次に、ブタ胎仔線維芽細胞へ、このU6-crRNAを加えたbpNLS-Cascade/ U6-crRNAに加え、bpNLS-Cascade とpCX-EGFP (CAG-EGFP)をco-transfectionして、EGFP陽性の細胞(トランスフェクション効率としては66.7%)をSortingして、そのsorting cellについて変異解析を行った 。
変異解析に使用したPrimerは、1875（CTCTCTAGGCTCAAGGCACTTGAGTGG）と1877(CACATTTGCGCATGTTTCGG)、1813(CCAGGACCACCAAATAATGG)と1864(TCATGCCTAGAGATGTACTCAGGGCCA)でnested PCRを行い、PCR後の泳動ではスメアが無いわけでは無かったが、結局数度にわたり、PCR産物をTOPOクローニングした。出来た大腸菌コロニーをシークエンスしたが、変異は検出できなかった。
また、前年度と同じくブタ血管内皮(SEC)を使い、SEC/GGTA1-KOの作出を試みるも、作出できていない。

Research Products

• [Journal Article] The hybrid CL-SP-D molecule has the potential to regulate xenogeneic rejection by human neutrophils more efficiently than CD47 (2024)
  • Author(s): K Iemitsu, R Sakai, A Maeda, K Gadomska, S Kogata, D Yasufuku, J Matsui, K Masahata, M Kamiyama, H Eguchi, S Matsumura, Y Kakuta, H Nagashima, H Okuyama, S Miyagawa
  • Journal Title: Transpl Immunol. Volume: 84 Pages: 102020
  • DOI: 10.1016/j.trim.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The suppression of xenogeneic NK cell degranulation by human CD31. (2023)
  • Author(s): Akira Maeda, Shuhei Kogata, Pei-Chi Lo, Keigo Iemitsu, Makiko Tani, Fitri Hasnaulia, Koki Takase, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 17th International Xenotransplantation Association
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] he hybrid molecule CL-SP-D has the potential to regulate xenogeneic rejection by human neutrophils (2023)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Keigo Iemitsu, Akira Maeda, Rieko Sakai, Daiki Yasufuku, Makiko Tani, Fitri Hasnaulia, Katarzyna Gadomska, Kazunori Masahata, Masafumi Kamiyama, Hiroshi Eguchi, Hiroshi Nagashima, Hiroomi Okuyama.
  • Organizer: The 17th International Xenotransplantation Association
  • Int'l Joint Research
• [Book] 異種移植研究の臨床への現状。 人工臓器、vol 52 no.3 (2023)
  • Author(s): 宮川周士
  • Total Pages: 37
  • Publisher: 日本人工臓器学会