Retinal optic nerve regeneration by human iPS cell-derived retinal ganglion cells and artificial sieve plate transplantation

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K19548
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 中澤 徹 東北大学, 医学系研究科, 教授 (30361075)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 航 東北大学, 大学病院, 助教 (20646442) ; 佐藤 孝太 東北大学, 医学系研究科, 助教 (50732327) ; Sharma Parmanand 東北大学, 大学病院, 准教授 (80451623)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2023-03-31
• Keywords: 網膜神経節細胞移植 / iPS細胞由来網膜神経節細胞

Outline of Annual Research Achievements

マウス眼内へヒトiPS-RGCを移植した際にその生存や神経突起伸長を確認するために、網膜神経節細胞の特異的マーカーであるPou4F2遺伝子へのGFP蛍光標識をCrispr/cas9の技術を利用してゲノム編集を行った。遺伝子ノックインベクター及びgRNAを遺伝子導入したiPS細胞からコロニーをピックアップした。iPS細胞及びGFP遺伝子内のプライマーを用いてノックインされたiPS細胞を同定した。ヘテロ接合体のノックイン株から立体網膜組織へ分化誘導し、蛍光発現を確認した。さらに凍結切片を作製し、抗Pou4F2抗体及び抗GFP抗体で免疫染色を施行したところ、局在の一致を認めており、網膜神経節細胞が蛍光標識されたiPS細胞であることを確認した。この立体網膜組織からauto MACS proを用いて網膜神経節細胞を単離した。既報で報告された維持培地で約3週間培養することが可能であった。さらに8週齢のC57BL/6マウスから眼球を摘出し角膜、水晶体、硝子体および網膜色素上皮を神経組織から慎重に取り除き十字の形に切り込みを入れた後、網膜をPDLでコーティングした6well plateに網膜神経節細胞層が上になるように静置した。静置した網膜にゆっくりと神経網膜培養液を添加した。次にヒトiPS細胞由来立体網膜組織を50日目まで維持培養し、auto MACS proを用いてiPS-RGCを単離した。単離したiPS-RGCを神経網膜培養液で懸濁し、Explant cultureで培養したマウス網膜上へ播種した。播種翌日にはマウス網膜上にGFP陽性の細胞を認めた。播種5日後にマウス網膜を抗GFP抗体で免疫染色を施行した。マウスの網膜上で神経突起伸長を有するGFP陽性細胞を認め、マウスの網膜上でヒトiPS-RGCが拒絶反応を受けず神経突起を伸長することが確認された。