2021 Fiscal Year Research-status Report

CRISPR/Cas系による新型コロナウイルス感染と気道上皮バリア破壊機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K19567
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	大森孝一京都大学, 医学研究科, 教授 (10233272)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	朝長啓造京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (10301920) 水田匡信京都大学, 医学研究科, 助教 (20777875) 宮本達雄山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (40452627) 大西弘恵京都大学, 医学研究科, 研究員 (50397634) 池川雅哉同志社大学, 生命医科学部, 教授 (60381943) 山本典生京都大学, 医学研究科, 准教授 (70378644) 岸本曜京都大学, 医学研究科, 助教 (80700517) 竹澤俊明国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長 (50301297)
Project Period (FY)	2021-07-09 – 2023-03-31
Keywords	COVID-19 / CRISPR/Cas9システム / ヒトiPS細胞由来気道上皮移植ラット / SARS-CoV-2 Spikeタンパク質 / シュードウイルス / ノックアウトスクリーニング
Outline of Annual Research Achievements	COVID-19に対しワクチンは個々のウイルスにのみ有効で、突然変異による無効化に対応できない。そこで適応範囲の広い治療薬が求められるが、現在試用されているRNA阻害薬等で確立されたものはない。申請者が研究対象とする気道上皮細胞は感染の入り口である。気道上皮細胞へのウイルス侵入と細胞間バリア破綻をブロックすることは重要であり、これにより感染や重症化を防御できるのではないかと考えた。そこで本研究では、新規メカニズムに基づく創薬ターゲットとなりうるタンパク質の同定を目的とし、近年確立されたCRISPR/Cas9システムによるゲノムワイドなハイスループットノックアウト法等によりSARS-CoV-2感染と細胞間バリア破綻に関与するタンパク質の網羅的探索に挑戦する。SARS-CoV-2 Spikeタンパク質発現シュードウイルスとヒトiPS細胞由来気道上皮移植ラットを同定タンパク質検証に用いることでin vivoでヒト細胞特異的な反応の検討を可能にし、生体に近い解析を行う。これによりCOVID-19治療薬のターゲット候補が見つかれば同属ウイルスによる新興感染症にも対応しうる可能性があり、波及効果は大きい。今年度はSARS-CoV-2 Spikeタンパク質発現シュードウイルスの作製とACE2恒常発現HEK293T細胞及びヒトiPS細胞由来気道上皮への感染実験を行い、ヒトiPS細胞由来気道上皮移植ラットへの噴霧によるウイルス感染のための予備検討を行った。また、スクリーニングに用いるCalu3細胞及び、CRISPR/Cas9システムによるゲノムワイドなハイスループットノックアウトスクリーニングに必要な試薬や機器のセットアップを行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason まず研究分担者の朝長によりSARS-CoV-2 Spikeタンパク質発現シュードウイルスが作製された。研究代表者ら京大耳鼻科のグループと研究分担者の宮本がゲノム編集技術により樹立したACE2恒常発現HEK293T細胞を用いて感染実験を行い、シュードウイルスがACE2の発現特異的に感染することを確認し、さらにヒトiPS細胞由来気道上皮への感染実験を行った。 In vivo実験での感染効率を検討する為、ヒトiPS細胞由来気道上皮の移植後生着効率を向上させるため、研究分担者の竹澤により市販のコラーゲンビトリゲル膜よりも抗原性が低く移植に有用と思われるブタアテロコラーゲン製のビトリゲル膜が作製され、生着効率における有効性の検討を進めている。研究分担者の池川により気管気道上皮と鼻腔気道上皮細胞でのタンパク質発現解析がすすめられた。研究代表者ら京大耳鼻科のグループはヒトiPS細胞由来気道上皮移植ラット気管への噴霧によるウイルス感染のための予備検討として感染実験に用いる予定のウイルス液と等量かつ同じ成分の培地を噴霧する予備検討を行い、生着細胞の剥離なく噴霧が行えることを確認した。また、スクリーニングに用いるCalu3細胞及び、CRISPR/Cas9システムによるゲノムワイドなハイスループットノックアウトスクリーニングに必要な試薬を導入し、P2サンプルを使用可能なセルソーターの使用申請などスクリーニングの準備を行った。準備は整ったもののCOVID-19感染トラブル発生や緊急事態宣言を考慮し、実際のスクリーニングは今年度は見送らざるを得なかった。
Strategy for Future Research Activity	今後以下の検討を行う。 I. CRISPR sgRNAライブラリを用いた機能欠損スクリーニングによりSARS-CoV-2の細胞内侵入に必要なタンパク質を探索する。Calu-3にCas9遺伝子を挿入し、恒常的に発現する株を作製し、ここにsgRNAライブラリを導入し、シュードウイルスを感染させる。感染が起こらなかったGFP-の細胞を次世代シークエンスにより解析し、挿入されたsg配列を検出し欠失遺伝子を同定する。またII. Envelopeタンパク質を用いた免疫沈降法により、上皮バリア破綻の際のターゲットとなるタンパク質を探索する。Calu3に、テトラサイクリン等でエピトープタグ付きEペプチドを発現誘導して免疫沈降を行い、結合タンパク質を同定する。そして、III. 網羅的に同定されたタンパク質が細胞内でどのように相互作用しウイルスの細胞内侵入とバリア破壊を実行するのか、ヒトiPS細胞由来気道上皮のin vitro, in vivo結合アッセイ系を用いて解析する。Iの同定遺伝子の発現をqPCR等により確認し、感染過程への関与を検討する。またIIの同定タンパク質のTJ破綻への関与を検討する。さらに、I, IIの同定タンパク質の、感染、バリア破綻における機能を免疫染色法、免疫電子顕微鏡法や免疫沈降法等で解析する。「気管気道上皮細胞よりSARS-CoV-2感染頻度が多い鼻腔気道上皮細胞でより発現が多く、気道構成細胞の中でも感染細胞種に多く発現している」事を指標とし、気管及び鼻腔上皮組織のイメージング質量解析データにより多数の同定タンパク質解析の優先順位を決める。さらに気管にヒトiPS細胞由来気道上皮を移植したラットを用い、in vivoでの感染時の同定タンパク質の挙動を解析する。これらの解析を通して新たな治療薬ターゲットの同定を目指す。
Causes of Carryover	COVID-19感染症の影響で予定していた試薬の納期が年度末に間に合わないことが判明した為、年度が替わってから購入することにしたため、次年度使用額が生じた。2022年4月以降に追試薬を購入し研究を進める予定である。