Basic research about fluid-fluid phase separation and membraneless organelles in sarcoma

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19571
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 秋末 敏宏 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (90379363)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹森 俊幸 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (20884456) ; 河本 旭哉 神戸大学, 医学部附属病院国際がん医療・研究センター, 特命講師 (30420558) ; 原 仁美 神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (40437489) ; 深瀬 直政 神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (60579324) ; 藤原 周一 神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (50909710)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 肉腫 / 細胞内小器官 / 相分離

Outline of Annual Research Achievements

2022年度（令和4年度）においては、骨肉腫細胞株MG63、KHOS、LM8、SaOS2中のストレス顆粒関連タンパク質(TIA-1、TIAR、G3BP1、G3BP2、CAPRIN-1、USP10)の発現の有無をウェスタンブロットで評価した。その結果、これらの細胞株で普通の培養下でストレス顆粒タンパク質が発現していることを確認した。具体的な結果は、G3BP2とCAPRIN-1はすべての細胞株において蛋白発現が認めた。G3BP1とUSP10はMG63、KHOSにのみ蛋白発現を認めた。TIA-1とTIARはすべての細胞株にて蛋白発現を認めたが、発現の程度は弱かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2021年度（令和3年度）においては、必要な細胞株の培養条件等の設定に時間を要し、また、ストレス顆粒関連蛋白の遺伝子発現を捉えるためのプライマー準備等に時間を要したため、実験の進捗が遅れていたが、2022年度（令和4年度）においては、実験の遅れを取り戻すことが出来た。

Strategy for Future Research Activity

2023年度（令和5年度）においては、前年の実験で発現が確認できているストレス顆粒関連タンパク質について、in vitroで各細胞株において蛍光免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で発現と局在を調べる。更にin vitroで低酸素環境下（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）のストレス顆粒タンパク質の遺伝子・タンパク質レベルでの発現の確認を行い、両群を比較検討する。また、低酸素環境下と通常培養での各々の群の細胞を回収しRNAシーケンスあるいはプロテオトーム解析など網羅的な手法を用いて解析する。

Causes of Carryover

2021年度（令和3年度）における実験の遂行が遅れた影響により、2022年度（令和4年度）では当初予定していた細胞内の蛋白局在を共焦点レーザー顕微鏡にて観察、さらに、低酸素状態（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）にて培養後、ストレス顆粒関連蛋白の遺伝子発現および蛋白発現を比較する予定であったが、これらの実験の遂行が出来なかったため、実験に必要な試薬等の購入を行わなかった。2023年度（令和5年度）においては、未実施の実験を速やかに行い、当初計画した2023年度（令和5年度）とともに使用する試薬等の購入に充てる。