2023 Fiscal Year Research-status Report
Basic research about fluid-fluid phase separation and membraneless organelles in sarcoma
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21K19571
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
秋末 敏宏 神戸大学, 保健学研究科, 教授 (90379363)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河本 旭哉 神戸大学, 医学部附属病院国際がん医療・研究センター, 医学研究員 (30420558) [Withdrawn]
竹森 俊幸 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (20884456)
原 仁美 神戸大学, 医学研究科, 助教 (40437489)
深瀬 直政 神戸大学, 医学部附属病院国際がん医療・研究センター, 特命助教 (60579324)
藤原 周一 神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (50909710)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Keywords | 肉腫 / 細胞内小器官 / 相分離 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度（令和５年度）においては、骨肉腫細胞株MG63、KHOS、LM8、SaOS2中のストレス顆粒関連タンパク質(TIA-1、TIAR、G3BP1、G3BP2、CAPRIN-1、USP10)の
発現の有無をウェスタンブロットで再評価した。その結果、これらの細胞株で普通の培養下でストレス顆粒タンパク質が発現していることを再度確認した。また、ストレス顆粒関連タンパク質について、in vitroで各細胞株において蛍光免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で発現と局在を調べる。更にin vitroで低酸素環境下（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）のストレス顆粒タンパク質の遺伝子・タンパク質レベルでの発現の確認を開始した。
これらの細胞株のうちMG63にレトロウイルスを用いてOCT3/4、KLF4,SOX2を導入し、人工骨肉腫幹細胞MG-OKSを作製した。MG-OKSの網羅的遺伝子解析でMG-63に比し有意な発現上昇を認めた遺伝子から、がん関連の報告があるSPRR1Aに着目し、in vitroにてMG-OKSにSPRR1A選択的siRNAを導入し(siMG-OKS)、SPRR1Aの発現をqRT-PCRで確認し、細胞形態を位相差顕微鏡で観察した。細胞増殖能をWST-8 assayでMG-OKSとsiMG-OKSで比較検討した。結果は、qRT-PCRにてsiMG-OKSでSPRR1Aの発現低下を確認した。siMG-OKSはMG-OKSと比較し細胞増殖能が有意に低下していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2023年度（令和５年度）においては、前年度までの実験結果の再現性を確認した。また、人工骨肉腫幹細胞MG-OKSを作製し、がん関連の報告があるSPRR1Aに着目し、さらに、本遺伝子の発現抑制の細胞形態と細胞増殖能への影響を検討し、肉腫細胞における膜を持たない細胞内小器官へのSPRR1Aの関与を検討した。研究計画はやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度（令和６年度）においては、前年度までの実験で発現が確認できているストレス顆粒関連タンパク質について、in vitroで各細胞株において蛍光免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で発現と局在を調べる。更にin vitroで低酸素環境下（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）のストレス顆粒タンパク質の遺伝子・タンパク質レベルでの発現の確認を行い、両群を比較検討する。また、低酸素環境下と通常培養での各々の群の細胞を回収しRNAシーケンスあるいはプロテオトーム解析など網羅的な手法を用いて解析する。さらに、人工骨肉腫幹細胞MG-OKSにおける膜を持たない細胞内小器官に関連するストレス顆粒関連タンパク質の発現を検討する。
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| Causes of Carryover |
2022年度（令和4年度）までに計画した実験の遂行が遅れた影響により、2023年度（令和５年度）では細胞内の蛋白局在を共焦点レーザー顕微鏡にて観察、さらに、低酸素状態（酸素１％および5％）と通常酸素状態（酸素20％）にて培養後、ストレス顆粒関連蛋白の遺伝子発現および蛋白発現を比較する予定であったが、これらの実験の遂行が遅れたため、実験に必要な試薬等の購入を一部行わなかった。2024年度（令和６年度）においては、実施途中の実験を速やかに行い、当初計画した2023年度（令和5年度）とともに使用する試薬等の購入に充てる。
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