2023 Fiscal Year Research-status Report
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21K19732
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
若尾 宏 獨協医科大学, 医学部, 教授 (10280950)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉本 智恵 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (60469955)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Keywords | グループ２型自然リンパ球(ILC2) / 好酸球性副鼻腔炎 / 酵素 / セルソーティング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はヒトグループ2型自然リンパ球(ILC2)を好酸球性副鼻腔炎患者の鼻ポリープから精製する技術を確立した。摘出手術後にポリープから脂肪組織を除き、メスで細断した。組織をGentleMACSチューブに入れて細胞培養液（RPMI1640培地に10%(vol/vol)牛胎児血清、抗生物質、ベータメルカプトエタノールが入ったもの）を添加し、GentleMACSTMにて組織をさらに細断した。細断後、遠心にて粘稠液を取り除いた。沈殿した細胞を酵素液（前述の細胞培養液にDNAase IとLiberaseを添加したもの）にて懸濁し、37°Cにて45 分間、回転混和した。その後、GentleMACSにて再び組織を細断した。細断後、100 ミクロメーターのセルストレーナーを通して、通過画分を遠心し、上清を取り除いた。赤血球を浸透圧により破壊したのち、40 ミクロメーターのセルストレーナーを通し、細胞培養液にて洗浄・遠心し、沈殿物（細胞）を細胞培養液に溶解した。この後、ILC2を精製するために当該細胞に発現する表面抗原をマーカーとして、MACSによるILC2の濃縮、FACSによるセルソーティングを行った。まず、抗CRTH-2抗体を用いてCRTH-2を発現する細胞を濃縮した。次にCRTH-2分子発現細胞をILC2以外の細胞と識別・分離するため蛍光標識したリニアージマーカー抗体群と混合し、別の蛍光で標識した抗CD161抗体、抗CD127抗体、抗CRTH-2抗体、並びに抗CD45抗体と反応させて、セルソーティングを行った。ILC2はリニアージマーカー(-)CD45(+)CD161(+) CD45(+)CD161(+)CRTH-2(+)CD127(+)として定義され、この細胞集団を分取・精製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今回、ILC2を好酸球性副鼻腔炎患者の鼻ポリープから精製するプロトコールを樹立することができた。本成果は我々がマウスで示したように、カビ抽出物刺激によって誘導される気道炎症においてMAIT細胞がヒトの系でもILC2の活性制御に寄与することを証明するための第一歩である。すでにこのプロコールを用いて4例のポリープからILC2の精製を実施ており、当プロトコールは十分な再現性を有している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は精製したヒトILC2を用いて、ILC2を活性化するとされるサイトカイン添加により、細胞増殖や炎症性サイトカイン産生が見られるのかをフローサイトメトリーを用いて明らかにする。さらに、ヒトMAIT細胞あるいはヒトiPS細胞由来MAIT細胞と共培養することで、ILC2増殖やILC2からの炎症性サイトカイン産生が抑制されるのか否かフローサイトメトリーや分子細胞生物学的な手法を用いて明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
ILC2とMAIT細胞の共培養により産生されるサイトカインを測定するための試薬を購入予定であったが、MAIT細胞の準備ができず翌年度に繰り越した。2024年度はサイトカイン測定用試薬を購入し、各種サイトカインを定量する。
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