2021 Fiscal Year Research-status Report

Paradigm shift in mutation research brought by next generation sequencing: from specific locus test to whole genome analysis

Research Project

Project/Area Number	21K19842
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	松本義久東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (20302672)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	権藤洋一東海大学, 医学部, 客員教授 (40225678)
Project Period (FY)	2021-07-09 – 2023-03-31
Keywords	変異 / 放射線 / ゲノム / 次世代シーケンサ
Outline of Annual Research Achievements	自然変異、放射線誘発変異の定量的研究は長年、外見や薬剤耐性などの表現型の変化を与える遺伝子に注目した特定座位(SLT)法によって行われてきた。近年、次世代シーケンシングを用いた全ゲノム解読(WGS)法を用いた変異研究が主に個体レベルで広がりつつある。WGS法はSLT法に比べて4桁から5桁感度が高いことが示されているが、単純に培養細胞系に適用することはできない。本研究は、WGS法を培養細胞でも変異解析に適用できる方法を開発し、全ゲノムを視野に、また、表現型の変化に依存せず、ゲノム配列の変化を捉える次世代変異研究を開拓することを目的としている。初年度は、長年SLT法による変異研究に使用されてきたヒトリンパ球由来TK6野生型細胞を材料として選択し、WGS法による実験系の確立とSLT法の比較などを目標として研究を行った。SLT法、WGS法のいずれにおいても、単一細胞に由来するクローンの取得、さらにその中の単一細胞に由来する二次クローンの取得が鍵となる。TK6は浮遊細胞であることから、方法として軟寒天中でのコロニー形成法とマルチウェルを用いた限外希釈法が考えられた。当初、いずれも収率が極めて低かったことから、至適条件の検討を行った。その結果、軟寒天中でのコロニー形成法において約30%のコロニー形成効率を得る条件を確立した。また、この細胞の増殖特性や放射線感受性など、本研究実施に当たって必要となる基礎的データを取得した。その他、DNA修復機構と変異との関連を調べるために、DNA修復遺伝子欠損細胞の作製を進めた。また、実際のWGSデータの取得に先立って、予想されるヒト細胞WGSデータの特徴を考察し、新たに生じた変異を抽出するための方法の検討を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 初年度には野生型細胞でのSLT法とWGS法による変異測定までを当初計画していた。上記の通り、鍵となる単一細胞由来クローンの取得効率が極めて低かったため、培養やコロニー形成の条件の検討を行った。これに時間を要したため、予定していた変異測定までには至らなかった。しかしながら、高いクローン取得効率が得られたことにより、今後の研究の加速とともに、良質なデータが得られることが期待される。また、現在進めているDNA修復遺伝子欠損細胞の作製においても単一クローンの取得は重要となる。これらのことから、全体的に当初計画から幾分の遅れが生じたものの、時間をかけて単一クローン取得のための良好な条件を見出した意義は大きかったと思われる。また、WGSデータの取得に先立って、解析方法について検討を行った。まず、これまでの研究で研究分担者・権藤が得たマウス個体のデータ、および研究代表者・松本が得たクローン化前のヒト線維芽細胞のデータを吟味した。これらを踏まえて、新たに生じた変異を抽出するためのストラテジーの検討とアルゴリズム開発を進めた。これによって、WGSデータが取得でき次第、変異抽出にすぐに取り掛かる準備が整いつつある。
Strategy for Future Research Activity	本研究では、WGSを用いた培養細胞での変異解析の新しい方法を確立することを目的としている。実現の鍵になるのは、単一細胞由来のクローンの繰り返し取得と、WGSデータからの変異の抽出である。単一細胞由来のクローン取得については、上記の通り条件を確立することができた。これに基づいて、変異解析や遺伝子欠損細胞作製を推進していきたい。WGSデータ解析について、研究分担者・権藤はマウスの世代間における変異解析の実績がある。ただし、近交系が利用可能なマウスと異なり、ヒト細胞には0.1%ほどSNPがあり、膨大な数のヘテロ接合およびホモ接合の変異候補がオリジナル細胞にすでに存在する。また、今回の方法は独自に着想した新しい方法であり、ヒトWGSデータから新規変異を抽出するトリオ解析などに通常用いられる方法は利用できないと考えられる。上記の通り、このような点を念頭におきながら、新たに生じた変異を抽出するためのストラテジーの検討とアルゴリズム開発をこれまでに進めてきた。今後、ビッグデータやプログラミングに精通した研究者の協力や助言を得ながら、研究を推進していきたいと考えている。
Causes of Carryover	当初、次世代シーケンサを用いた全ゲノム解析(１件約15万円)を予定していたが、研究実績の概要などに記載したように、良質なサンプルを得るために重要な単一細胞由来クローン取得条件の検討を慎重に行い、全ゲノム解析は令和3年度には実施しなかった。条件は確立したので、令和4年度前半にサンプル調製を行い、全ゲノム解析を開始する予定である。