プログラム細胞死細胞を原料とした新しい人工細胞外小胞の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19891
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 岸田 晶夫 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 教授 (60224929)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 剛 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 准教授 (10393216) ; 橋本 良秀 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (40638384)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 人工細胞外小胞 / プログラム細胞死 / 高静水圧処理 / エクストルーダー

Outline of Annual Research Achievements

プログラム細胞死を誘導した細胞を用いた人工細胞外小胞の調製と物性解析を行った。調製条件の検討のために、安定して培養が可能ながん細胞（HeLa細胞）を用いた。プログラム細胞死様式として、高静水圧誘導細胞死を選択し、圧力条件を変更してin vitroにて各様式の細胞死を誘導した。得られたプログラム細胞死誘導細胞を回収し、残存しているDNAを分解するために核酸分解酵素(DNase）処理を行った。エクスルーダーにて物理的に小胞を形成させ細胞外小胞を得た。上記の手法によって、細胞外小胞を得ることができた。細胞外小胞のサイズを動的光散乱（DLS）を用いて解析した。以上の検討により、下記の点が明らかになった。
得られた細胞外小胞のサイズ分布はかなり広いことがわかった。高静水圧処理では細胞膜の圧縮が生じることが考えられ、これがエクストルーダーの膜孔を通過する際にばらつきを生じさせていることが考えられた。確実な細胞膜破壊のために、圧力を下げることは避け、エクストルーダーの条件検討を行い、サイズコントロールを試みた。エクストルーダーの取り扱い方など検討が必要な条件項目が多く、安定した細胞外小胞を得るために時間を要したが、一定の分布の細胞外小胞を得られる条件範囲を見いだし、再現性を確認した。再現性を得るための要点として、圧力処理した細胞の回収方法（取扱法）およびエクストルーダーの膜孔を通過させる回数の影響が大きいことがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

高静水圧処理によってプログラム細胞死を誘導した細胞を用いて細胞外小胞を得るコンセプトを実証できた。サイズ分布の適正化を試み、エクストルーダーの処理条件を検討することで比較的単分散の細胞外小胞の調製に成功した。細胞を高静水圧で死滅化し、DNaseで処理して元の細胞のDNAを除去する等の処理を施した後でも球形を保つことを確認できた。調製方法が確立できたことで、以降の研究の進展が見込まれる。

Strategy for Future Research Activity

HeLa細胞を用いた細胞外小胞について、DNAの残存の確認を行う。これまでの脱細胞化処理の条件では組織内に存在する細胞のDNAはほぼ完全に除去できることが確認できているが、得られた細胞外小胞についても確認を行う。
種々の細胞を用いて細胞外小胞を作成する。細胞によって得られる細胞外小胞のサイズ分布の差異について明らかにする。また元の細胞の特異的分子（膜タンパク質、糖鎖など）の確認を行う。
調製した細胞外小胞の、生物学的活性について細胞培養を用いて確認する。また、細胞外小胞作成時に低分子を共存させて、それの内包化について検討する。