眼炎症疾患診断を可能とするin vivoシングルセルイメージン グ技術の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19917
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中村 大輔 九州大学, システム情報科学研究院, 准教授 (40444864)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 園田 康平 九州大学, 医学研究院, 教授 (10294943) ; 八幡 信代 九州大学, 医学研究院, 准教授 (90315812)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2023-03-31
• Keywords: 眼炎症疾患 / 自発蛍光 / 非侵襲診断

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，眼科医でも原因特定が困難な眼炎症疾患の新たな診断情報を与える革新的な非侵襲眼内診断技術を開発するために，眼内の炎症細胞や腫瘍細胞がもつ固有の微弱な自発蛍光をリアルタイムかつシングルセルレベルに識別可能なイメージングの技術基盤を築くことを目的としている．R3年度は，【課題1】フローサイトメトリーを利用した採取組織細胞の蛍光データベース構築と【課題2-1】眼内浮遊細胞のin vivo非侵襲イメージングのための細隙灯顕微鏡ベース超高感度分光イメージング装置の構築を実施した．
蛍光データベース構築の成果：2種類の中枢神経悪性リンパ腫細胞株を入手し，フローサイトメトリーを用いて異なる４波長のレーザー光 (violet，blue，yellowgreen，red) にて中枢神経悪性リンパ腫細胞株と正常・活性化リンパ球を励起し，異なる16波長の発光波長シグナル強度を検出器で比べた．いずれの励起波長でもリンパ腫細胞株と正常リンパ球の自発蛍光の違いを検出できた．検出波長によってシグナル強度に違いがみられ，Blueレーザーによる励起時の発光強度が最も高いことがわかった．
細隙灯顕微鏡ベース超高感度分光イメージング装置の構築の成果：眼科診療に用いている細隙灯顕微鏡に高感度EMCCDカメラを搭載した細胞自発蛍光検出システムを構築した．さらに，blueレーザー光源（485nm）を導入し，ガラスセル内のリンパ腫細胞，正常リンパ球の散乱光をEMCCDで可視化できることを確認した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

R3年度は，(1)リンパ腫細胞と正常細胞に対して適した励起波長と最も発光強度の高い波長を明らかにすること，(2)眼内浮遊細胞の非侵襲イメージングのための細隙灯顕微鏡に超高感度カメラを搭載することを主要な目標として計画していた．いずれもほぼ計画通りに進展している．ただし，細胞からの発光強度が想定以上に微弱であることが判明したため，励起レーザーの照射手法に工夫が必要である．

Strategy for Future Research Activity

R4度は，まず，細胞に対するBlueレーザーの照射手法を連続照射からパルス照射に変更し，細胞に対するダメージや光退色の抑制効果を調査する．その後，ガラスセル内の細胞にレーザー光を照射し，細胞からの自発蛍光をバンドバスフィルタを介した高感度EMCCDカメラで画像計測し，分光イメージングの可能性を調査する．さらに，in vivo計測に向けた眼内へのレーザー光導入光学系構築や微弱な蛍光検出を実現するためのカメラの各種条件設定といった分光イメージング装置開発のための指針を実験的に明らかにする．

Causes of Carryover

当初，分光イメージングのための複数のバンドパスフィルタを準備することを想定していたが，フローサイトメトリーで適した波長を特定することができたため，フィルタ用に設けていた物品費を節約できたことが理由である．一方，研究を進める過程で細胞からの自発蛍光が想定以上に微弱であることが判明したため，R4年度においては，感度向上のための光学系改良が新たに必要であり，この光学系構築を計画している．