2021 Fiscal Year Research-status Report
ヒト末梢神経系のin vitro再構成系の構築による痛み緩和メカニズムの解明
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21K19927
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
岡 浩太郎 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (10276412)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 痛み緩和のメカニズム / 細胞外ATPイメージング / Caイメージング / オキシトシン / 歯髄幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではヒトケラチノサイトと末梢神経細胞（これは歯髄幹細胞から分化させる）を共培養することにより、ヒト末梢神経系を再構築して、末梢での痛み伝達とその緩和のメカニズムを明らかにすることを目指している。本年度はこの研究を行う上で重要である、（１）歯髄幹細胞から末梢神経細胞を誘導する方法の探索と（２）末梢での痛みシグナル伝達を可視化する技術の開発を行った。
（１）に関しては、歯髄幹細胞の末梢神経系への安定で効率の良い分化誘導を行わせるために、海馬神経細胞のコンディションメディウムとグリア細胞のコンディションメディウムの双方に対する分化誘導を調べた。この結果上記２つのメディウムはともに歯髄幹細胞を従来の培養方法よりもよく生育させることがわかった。またこれらのコンディションメディウムで培養させた歯髄幹細胞に高濃度KClで刺激した際の興奮性をカルシウムイメージングで調べたところ、神経様に興奮することがわかった。一方で中枢神経系で主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸では、神経応答は見られなかった。このことから、中枢系のコンディションメディウムを利用しても中枢様の神経細胞には分化しないことがわかった。
（２）に関しては、ヒトケラチノサイトとラット後根神経節細胞との共培養系を構築し、ケラチノサイトをガラスピペットで力学刺激を加えた際のケラチノサイトから神経細胞への痛み情報の伝達を細胞内カルシウムイメージングとケラチノサイト外側に発現させた細胞外ATP濃度を計測する系で調べた。この実験系により、ケラチノサイトへの機械刺激に応じてケラチノサイトは細胞外にATPを放出し、このATPが後根神経節細胞を興奮させていることを可視化できた。痛み緩和に関与されていると考えられているオキシトシンはケラチノサイトでも応答感受性を鈍化させる可能性も見出せた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記（１）により歯髄幹細胞を末梢神経細胞に分化誘導させるために適切なコンディションディウムの選択についての目処が立った。またカルシウムイメージングにより、分化させた細胞についてその機能を調べることができるようになった。
また（２）に関しては、ケラチノサイトと神経細胞の共培養系を最終的に構築し、この細胞間での情報伝達を調べる必要があるが、今回神経細胞はラット神経細胞ではあるものの、将来オールヒト系細胞での実験が可能となった際にも利用する系を構築することができた。特にケラチノサイトと神経細胞への情報伝達物質である、細胞外ATPを検出するための新規なイメージング手法の開発とそれが適切に機能することを確認した。これらの進捗は本研究計画を遂行する上で大きな進展であると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記（１）に関してはコンディションメディウムをさらに調整し、至適な条件を探す。またカルシムイメージング法で中枢神経系伝達物質であるグルタミン酸での応答を調べているのみであるが、末梢神経系の神経伝達物質で応答が出ることも調査する。さらに最近になって歯髄幹細胞から効率的に神経細胞を誘導する様々な方法について論文が発表されてきている。その中でも本研究へも利用が可能なRho kinase阻害剤をも行いた分化手法などについては検討を行う。
また（２）に関しては、上記（１）で至適条件が決められたら、ケラチノサイトとの共培養条件の検討を進めるとともに、細胞外ATP、細胞内カルシウムイオンの可視化を進める。さらにオキシトシンでケラチノサイトのATPに対する応答性が低下することがわかってきたが、そのメカニズムについても実験的に調べる。また中枢への痛み刺激の可視化方法として、神経細胞に関しては膜電位イメージングの可能性についても検討する。また特にこれまでの実験ではガラスピペットでの刺激強度は特に制御しておらず、その代わりにケラチノサイトのカルシウム応答の大小を刺激強度の指標としてきた。より定量的な機械刺激をケラチノサイトに加えるために、例えばpiezo素子を用いた定量的刺激方法などについても検討を進める。
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| Causes of Carryover |
2022年3月にラット2匹を使用した実験を予定していたが、2月に実施した実験結果の解析に時間を要しこの実験を延期することになった。これに伴い、3月に予定していたラットの発注が中止となり次年度使用額が生じた。次年度使用額分については、延期した実験に使用するラット購入費用として使用予定である。
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