H2抗体によるキネシンモーター阻害機構の解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K20621
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 千葉 杏子 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (10795701)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2023-03-31
• Keywords: キネシン / KIF5A / リコンビナント抗体 / scFv / ALS / 筋萎縮性側索硬化症

Outline of Annual Research Achievements

キネシン(KIF5A、KIF5B、KIF5C）に対するモノクローナル抗体であるH1およびH2を発現するハイブリドーマから５’RACE法を用いることで抗体遺伝子のcDNAをクローニングすることに成功した。cDNAをベクターにクローニングしサンガーシークエンス法を用いて抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖の配列を決定した。H1とH2のうちで、キネシンに対するモノクローナル抗体H2が広く使われていることからこのcDNAをクローニングを利用して、発現ベクターを作成した。この発現ベクターを大量培養した293FT細胞にトランスフェクションし、七十二時間後に培養上清を回収した。この培養上清を用いてウエスタンブロットおよび細胞の蛍光抗体法を実施したところ、リコンビナント抗体はどちらの手法でも内在性のキネシンを十分に検出できることがわかった。cDNAの組換えによって一本鎖抗体（ｓｃFv)を作成した。このH2由来の一本鎖抗体もまたウエスタンブロット法および蛍光抗体法で使用可能であることがわかった。KIF5Aの遺伝的変異は筋萎縮性側索硬化症（ALS)の原因となっている。ALS変異をもつKIF5Aは細胞内に凝集を形成することがわかった。作成したH2リコンビナント抗体はALS変異によって凝集したKIF5Aを細胞内で検出するのに用いることもできた。このことからこのリコンビナント抗体は基礎研究ばかりではなく疾患の解析や病理学にも用いることができる可能性がある。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

H2のリコンビナント抗体を作成することに成功した。また、予想外にscFvを作成し、それが十分に実用可能であることを示すことにも成功した。この研究の過程で解析したKIF5Aの筋萎縮性側索硬化症変異体がこれまでに言われていたのと異なり、凝集を形成することを示すことができた(Nakano et al., in press)。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画通り作成したリコンビナントH2抗体を蛍光ラベルしたものを作成し、一分子の運動観察の系に混ぜることでどのような効果を持つのかを解析する。