2022 Fiscal Year Annual Research Report
変異プロファイリング法を用いたRNA-タンパク質相互作用解析法の開発
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21K20638
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
山上 龍太 愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 助教 (70767227)
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| Project Period (FY) |
2021-08-30 – 2023-03-31
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| Keywords | tRNA / RNAメチル化酵素 / tRNA修飾 / 次世代シーケンス / 変異プロファイリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、次世代DNAシーケンサーを用いたRNAの網羅解析法を開発し、RNAの配列・構造とRNA成熟化酵素の相互作用をハイスループットに解析することで、RNAによる遺伝子の発現制御機構を理解しようというものです。近年の研究より、RNAの配列や構造因子は、多くの遺伝子の発現を調節することが明らかになっています。その一方で、RNAは、転写後にプロセシングやRNA修飾などの様々な成熟過程を経て、その機能性を獲得します。しかしながら、「RNAの配列と構造がどのようにしてRNA成熟化酵素と相互作用し、結果的にどのようにRNA成熟化機構を制御するか」の詳細は、明らかではありませんでした。そこで、本研究では、RNAメチル化酵素をモデルとして、tRNAとtRNAメチル化酵素の基質認識機構をハイスループットに解析する手法を開発することを研究目的としました。
初年度は、tRNAとRNAメチル化酵素TrmKの相互作用を1塩基の分解能で検出するtRNA-MaP法を開発し、全tRNA転写産物を用いてTrmKの基質認識機構を解析しました。その結果、TrmKは、tRNAのほぼ全ての三次構造を認識していることがわかりました。そこで、最終年度は、好熱性真正細菌のGeobachillus stearothermophilusからtRNAを単離し、tRNA-MaP解析とタンパク質のホモロジー解析によって、tRNA中に含まれる修飾ヌクレオシドとその責任酵素を予測しました。また、単一のtRNA転写産物を用いて、酵素反応速度論解析をしたところ、tRNA-MaPは、既存の方法と同等の感度と定量性があることが示唆されました。
これらの成果を共同責任著者として、Journal of Biological Chemistry誌に出版しました。
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