2021 Fiscal Year Research-status Report
Revealing the mechanism behind pronuclear selection in Tetrahymena thermophila
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21K20643
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
明松 隆彦 日本大学, 文理学部, 助教 (90906637)
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2021-08-30 – 2023-03-31
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| Keywords | テトラヒメナ / 繊毛虫 / 配偶子 / 核 / 核膜 / 運命決定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先行研究より、配偶核特異的に発現するSEMI1というタンパク質を同定している。SEMI1は、配偶核の核膜に強く発現する成熟因子の一つであり、他の成熟因子や運命決定因子との親和性が予想される。R3年度は、SEMI1とタンパク質間相互作用を示す遺伝子、並びに発現パターンの似た遺伝子をスクリーニングし、配偶核形成に不全を示す２種類の遺伝子（MFS1とDEAR3）を新たに確認した。
MFS1は、輸送体の一種であるMajor facilitator superfamily様のタンパク質をコードする遺伝子で、配偶核の選択現象に必須であった。ノックアウト株では、配偶核に特有なヒストンのアセチル化が一切検出されなかったことから、選択時に生じるクロマチン再編に影響が出ていると考えられる。タンパク質として発現したMFS1は、配偶核には局在せず、核膜近傍に位置する小胞膜上に強く発現していた。これらの結果は、選択現象における核輸送の重要性と、輸送体としてのMFS様タンパク質の関与を示唆している。
DEAR3は、テトラヒメナに固有なタンパク質をコードする遺伝子で、SEMI1ノックアウト株と同一の表現型を示した。すなわち、４個の半数体小核のうち、１核が正常に選択されるものの、この核が異性間で交換可能な配偶核へ成熟しなかった。タンパク質として発現したDEAR3は、SEMI1と同じく配偶核の核膜に強く発現することから、成熟を運命付けられた１核には、核膜タンパク質の再構成が起こると考えられる。DEAR3とSEMI1に関して、一方の成熟タンパク質の局在が、もう一方の成熟タンパク質の局在を規定している可能性があり、これを検証する必要がある。
R3年度の進展によって、半数体小核の運命決定と成熟に関連する遺伝子が新たに見つかり、配偶核形成に至る一連の分子機構をより詳細に解析するための足がかりを掴んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
配偶核の選択に至るプロセスは、減数分裂完了後、４つの半数体小核へのDNA二重鎖切断（DSB）導入を起点とする。DSB導入後、１核にのみ修復が起こり、これが配偶核として選択される。これまで、DSB導入が起こらないノックアウト株は取得していたが、修復が起こらないノックアウト株は確立されていなかった。今回取得したMFS様遺伝子ノックアウト株は、DSBは導入されるが、修復が不全となる表現型を示しており、選択現象の中心的メカニズムを解析する上で極めて重要な細胞株である。同様に、DEAR3遺伝子ノックアウト株の取得も、DNA修復後の成熟プロセスを解析する上で画期的である。このような進歩状況から、本研究は概ね順調に進展していると区分できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回発見した２種類の遺伝子ノックアウト株について、核選択現象の分子指標を用いて、より詳細な表現型解析を行う。タンパク質の複合体候補を探索する場合は、テトラヒメナ細胞内で相互作用するタンパク質を免疫沈降法により解析する。また、両遺伝子について部位特異的変異導入実験を行い、核の運命決定と成熟に重要なアミノ酸残基の特定を目指す。
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| Causes of Carryover |
R3年度に情報通信研究機構の顕微鏡を使用する予定であったが、新型コロナウイルス感染防止の観点から当施設への立ち入りが叶わず、別の研究計画を先に遂行したために未使用額が生じた。このため、予定していた実験はR4年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。具体的には、生細胞観察に用いる蛍光タンパク質発現株を作成するための試薬や消耗品、及び観察に必要な各種細胞染色用色素にかかる費用として使用する。
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