イネのCa2+依存性プロテインキナーゼ8による抗菌タンパク質分泌制御機構の解明

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K20664
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 神村 麻友 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 助教 (00749012)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2025-03-31
• Keywords: シグナル伝達 / キナーゼ / 抗菌タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、病原細菌に対するイネの免疫反応として、OsCPK8キナーゼが小胞輸送に関与するArfのGDP-GTP交換反応を介して、抗菌タンパク質の分泌を制御するモデルを検証し、これらの制御因子の働きを明らかにすることを目的としている。
病原細菌（非病原性菌株）接種時の培養上清に抗菌活性が認められるかを明らかにするため、イネ培養細胞の培養上清および、アポプラスト抽出液の抗菌活性を調べた。しかしながら、培養上清およびアポプラスト抽出液や病原細菌の濃度を検討しているが、顕著な抗菌活性が認められる系の構築には至っていない。そこで今年度はアポプラスト分泌の指標となるタンパク質を同定し、抗菌活性を調べるための指標とする。イネ病原性細菌の非病原性細菌株接種時のOsCPK8キナーゼ遺伝子発現抑制細胞株のトランスクリプトーム解析の結果から、コントロール株と比べて有意に発現抑制される遺伝子を抽出後、分泌予測サイトApoplastPを用いてアポプラストに局在するタンパク質を調べた。その結果、既知の抗菌タンパク質であるディフェンシンを含む、いくつかの遺伝子が得られた。これらの遺伝子をクローニングし、現在局在の確認をしているところである。
また、OsCPK8キナーゼがArfのGDP-GTP交換反応を担うArf-GEFと相互作用するのかを確認するため、酵母ツーハイブリット法を用いて相互作用確認を行ったが、どのArf-GEFとも相互作用は認められなかった。別の相互作用方法で調べるためにプラスミドを構築中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

子の体調不良が続き連続した実験計画が出来なかったため。

Strategy for Future Research Activity

今後は指標とする分泌タンパク質の選定を行うために局在確認を進め、アポプラスト局在のタンパク質を同定する。同定した分泌指標タンパク質がイネ培養細胞上清やアポプラスト抽出液内に存在しているかウエスタンブロットで確認することで、抽出ができているのかの確認を行う。また、抗体が手に入らない場合は、LC-MSでの解析を試みる。
Arf-GEFとOsCPK8キナーゼとの相互作用はリコンビナントタンパク質を作製し、共免疫沈降法を用いて解析を行う。

Causes of Carryover

研究の進展がなく学会への参加や論文の執筆に至っていないので、次年度使用額が生じている。
次年度は、分泌タンパク質の局在解析に必要な物品、およびタンパク質発現実験に必要な物品の購入に充てる。