多剤耐性緑膿菌による人工呼吸器関連肺炎モデルにおけるIL-22の有効性の検討

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K20763
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 岩永 直樹 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (40912499)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2024-03-31
• Keywords: 薬剤耐性緑膿菌 / 人工呼吸器関連肺炎 / IL-22

Outline of Annual Research Achievements

多剤耐性緑膿菌による院内肺炎、特に人工呼吸器関連肺炎（VAP）は有効な治療法が確立されておらず、死亡率も高い。一方で、Type17サイトカイン (IL-17、IL-22) は上下気道や腸管の粘膜免疫で重要な役割を担っており、IL-17は好中球の遊走等によって感染防御に寄与している 。一方でIL-22は、抗菌ペプチドの産生や組織の修復、更にはタイトジャンクションの増強等、粘膜免疫において不可欠なものである。
まず、耐性緑膿菌によるVAPモデル確立を目指したが、気管内に約3mmのチューブを留置する技術の習得に時間を要し、緑膿菌は適度に肺炎を起こす菌量のrangeが極めて狭いため、至適菌量の設定に多くの時間を要したが、最終的に1.0x10^6 CFU/mouseで感染実験を行うに至った。
1ugのIL-22:Fcを感染2時間前に気管内投与し、生存・体重変化を比較したが有意な改善を認めなかったが、5ugを感染4時間前に腹腔内投与すると、有意差をもって生存率を改善させることが示され、再現性も確認できた (Log-rank test, p=0.038)。感染24時間後の肺内生菌数を比較すると、コントロール群と比較して、IL-22:Fc治療群で有意に減少していた (Mann whitney test, p=0.0093)。今後はフローサイトメトリーで肺内炎症細胞の評価を行い、マクロファージやNK細胞、自然リンパ球等の感染免疫の初期応答で重要な免疫細胞の振る舞いを明らかにする。更にreal time RT-PCRでサイトカイン・ケモカインの評価を行い、IL-22:Fcの感染4時間後投与でも病態の改善をもたらすことが可能かどうか、同様の検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究実績の概要でも述べたように、モデルの確立に想定以上の時間を要した。ポジティブデータも出ているので、今後は研究を加速させ、令和5年度の完成を目指す。

Strategy for Future Research Activity

感染4時間前に5ugのIL-22:Fcを腹腔内投与し、感染24時間後にBALを行い、BALF中のサイトカイン (IL-17A, IFNg, IL-22)の測定、肺組織中のIl1, Il6, Tnfa, Il17a, Il17f, Il22, Il22ra2, Ccr2, Ccl2, Reg3g, S100a8, S100a9, Saa1, Elaneの発現をreal time RT-PCRで評価する。肺内炎症細胞の評価のため、肺のDigestion検体をflow cytometryで評価する。また肺組織をH&E染色で比較する。最終的に感染12時間後 (菌量によるバイアスがかからないように、両群のCFUに差がないことを確認する) の肺検体を用いてunbiased Bulk RNA sequencingを行い、RNAの発現を網羅的に解析する。上述の検討で抗菌ペプチド (Reg3g, S100a8, S100a9)に有意差を認めた場合には、同ペプチドの気管内投与で病態を改善できるか確認する。病態の再現性確認のために、抗IL-22抗体の腹腔内投与で病態の悪化を認めるかも検討する。

Causes of Carryover

薬剤耐性緑膿菌による人工呼吸器関連肺炎マウスモデルの確立に想定以上に時間を要したためやや計画の遂行が遅れている。フローサイトメトリーやreal time RT-PCRに必要な試薬は既に購入しており、次年度の予算の多くはマウスの購入費・飼育費等に支出することになる。