2021 Fiscal Year Research-status Report
単核貪食細胞分化モデルを用いた普遍的細胞分化メカニズムの解読
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21K20936
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
西村 耕太郎 横浜市立大学, 医学部, 助教 (30909982)
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| Project Period (FY) |
2021-08-30 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、系譜特異的転写因子がどのように普遍的な制御因子と協調して遺伝子発現を制御しているのかをエピゲノムを中心に明らかにし、細胞分化の普遍的メカニズムを明らかにすることである。今年度まず単核貪食細胞分化に関わるエピゲノム因子をCRISPR-Cas9スクリーニングによる同定するため、 Cas9発現細胞株を作成した。さらにコントロールsgRNAによりCas9による遺伝子改変活性を確認した。現在さらにsgRNAライブラリー導入を進めている。また、マウス個体の骨髄由来細胞へのCas9-sgRNAの導入を試みるため、アデノウイルス随伴ベクター（AAV)による遺伝子導入の検討を行った。ヒト細胞株、並びにマウス骨髄幹前駆細胞への感染条件を検討した結果良好な感染効率が得られている。APEX2ビオチン化反応実験を進めるため、細胞内でビオチン化反応を起こすための条件を検討し最適化した。またビオチン化分子の濃縮と質量分析による検出を行い、実験系が機能していることを確認した。ゲノムDNAにAPEX配列を導入するため、骨髄細胞へのCas9-RNPエレクトロポレーションとAAVドナーテンプレート感染による導入を検討した。ヒト細胞株では良好な導入効率が得られているが、マウス骨髄細胞ではさらなる改善が必要である。さらに sgRNAスクリーニングやAPEX2による近位標識により同定された分子の造血細胞における表現型の解析のため、FACSによる解析の最適化を行なった。今年度の研究により今後の解析基盤が確立された。次年度での迅速かつ正確な研究遂行が可能になると考えられ、現在進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cas9発現細胞の作成、造血幹細胞への感染、ビオチン化反応の最適化、AAV/Cas9RNPを用いた遺伝子導入など研究に必要な基本的な設定の最適化はほぼ完了しつつある。
これらを使って、次年度加速的に解析を進められると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
作成したCas9細胞にエピゲノムsgRNAライブラリーを導入する。導入した細胞株を分化誘導し次世代シークエンスにより解析、分化過程で失われたsgRNAクローンから分化誘導に必須のエピゲノム因子、その逆にコピー数が増加したsgRNAクローンから分化を抑制、または分化に伴う増殖停止を制御する因子の同定を試みる。APEX2導入細胞を作成し、ビオチン化反応後、質量分析により解析する。同定したエピゲノム因子とその分子標的の変化を、細胞株を用いて生化学的また次世代シークエンス(RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq 、Hi-Cなど)で解析し、有意な候補因子を絞り込む。最終的に絞り込んだエピゲノム因子のノックアウトマウスを入手または作成し、生体骨髄中の造血幹細胞、単核貪食系前駆細胞や末梢組織中の分化細胞を細胞株と同様に解析する。さらに遺伝子改変マウスと組み合わせ、その分子がどのようにエピゲノム変化、マウス個体の表現型に影響を与えるかを解明する。
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