レポーター遺伝子導入マウスを用いた間葉系幹細胞の由来の違いによる歯胚再生能力解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K21055
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 大堀 悠美 東北大学, 歯学研究科, 学術研究員 (70908441)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2024-03-31
• Keywords: 歯胚再生 / 間葉系幹細胞（MSC） / 神経堤 / 器官原基法

Outline of Annual Research Achievements

近年，歯の欠損に対する治療として天然歯と同等の構造・機能回復が可能な歯胚再生療法が着目されている．しかしながら歯胚を形成する歯原性細胞は胎生期に存在するため，成体由来細胞のみで機能的な歯胚を再生させる段階には至っていない．一方で，骨髄間葉系幹細胞（BM-MSC）が歯原性間葉としての能力を有し，歯胚構造の再生が報告されているが，その再生効率が低いことが課題となっている．そこで様々な細胞が混在するBM-MSCの中に歯原性間葉と同じ神経堤由来細胞が含まれていることに着目し，申請者は神経堤由来BM-MSCを用いることで歯胚再生効率が向上するとの仮説を立てた．このために神経堤由来細胞を永続的にトレース可能なP0-cre/CAG-CAT-EGFPマウスを用いてP0陽性神経堤由来MSC・P0陰性MSCを分取し，歯胚再生を試みることで，MSCの発生由来の違いが歯胚再生能力に及ぼす影響を明らかにする．さらに当研究室では，BM-MSCを一定条件下で振盪培養することで，BM-MSC細胞塊を形成し，神経堤幹細胞としての性質を増強させる培養法を開発した．この新規浮遊振盪培養法により神経堤由来MSC細胞塊を形成することでさらなる歯胚再生の効率化を試みる．
まず予備実験として「器官原基法」を応用し，マウス胎仔から分取した歯胚上皮とBM-MSCセルラインから振盪培養法で形成したMSC細胞塊を組み合わせることで歯胚再生を試みた．試験管内で7日間培養し，マウス腎皮膜下に移植をしたところ，一部歯胚様構造の形成を認めた．過去の報告よりもその出現頻度は高く，浮遊振盪培養法による歯胚再生効率化が期待される．今後トランスジェニックマウスから分取したMSCを用いた実験を行い，解析していく予定である．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請者は令和3年10月から令和4年3月まで産前産後および育児休暇を取得しており，その間研究は休止していたため，当初の研究計画よりやや遅れがでている．補助事業期間延長申請は提出中であり，研究期間の延長によって研究の遅れを取り戻す予定である．

Strategy for Future Research Activity

今後の研究実施計画では、①神経堤由来BM-MSCの性質の検証、②神経堤由来BM-MSCの歯胚再生能力の検証、③成体幹細胞を用いた歯胚再生の評価を計画している。
産休後の研究実施計画の主な軌道修正として、①神経堤由来BM-MSCの性質を検証するため、神経堤由来BM-MSCの歯原性間葉としての性質検証から骨再生能解析へと修正する。過去の研究より、中胚葉から発生する体幹由来BM-MSCと神経堤から発生する頭頚部由来BM-MSCに骨再生能が異なることが報告されている。そこで本実験ではP0-cre/CAG-CAT-EGFPマウスの骨髄からP0陽性神経堤由来MSC・P0陰性MSCを分取し、それぞれの骨再生能を解析することで性質の違いを検証する。またP0陽性・陰性MSCの歯原性間葉関連遺伝子の発現をPCRにて解析することで、発生由来の異なるBM-MSCの歯原性間葉としての性質の違いを検証する。さらに当研究班が開発した振盪培養法で形成したBM-MSC細胞塊は歯原性間葉としての性質が向上するかをPCRによる遺伝子解析、組織学的解析を行うことで、遅れを取り戻す。
次に②神経堤由来BM-MSCの歯胚再生能力をin vivoにて検証する。本実験で「器官原基法」を応用し、マウス胎児より分取した歯胚上皮細胞とP0陽性神経堤由来MSC・P0陰性MSCから形成したMSC細胞塊を組み合わせてマウス腎皮膜下に移植することで歯胚再生を試み、どちらが効率的に歯胚構造を誘導可能か検証する。
最後に③成体幹細胞を用いた歯胚再生の評価をする。当研究班が独自に誘導したiPS細胞由来歯原性上皮細胞と歯胚再生効率の高いBM-MSCを組み合わせてマウス腎皮膜下へと移植し、歯胚の再生を試みる。この方法が成功すれば、成体幹細胞のみで歯胚再生を行うことが可能となり、再生歯科学を飛躍的に発展させる技術となりうる．

Causes of Carryover

申請者は令和3年10月から令和4年3月まで産前産後および育児休暇を取得しており，その間研究活動を休止していた．補助事業期間延長承認申請は提出中であり，研究期間の延長にともない，当初の研究計画を後ろ倒しにして実施する予定である．