タンパク質のリン酸化状態に着目した生活習慣病の病態把握及び治療への応用

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K21247
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 佐藤 葵 新潟大学, 医学部, 技術職員 (10808752)
• Project Period (FY): 2021-08-30 – 2024-03-31
• Keywords: Phos-tag対角線電気泳動 / 生活習慣病 / リン酸化タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではタンパク質の機能的なリン酸化状態を検出及び同定することができる新技術、Phos-tag対角線電気泳動法を利用して肥満や糖尿病といった生活習慣病に係るタンパク質のリン酸化状態に着目した病態解明を目的としている。
本年は前年の課題の解消・回避法の検討及び、次ステップへのサンプル調整を主に行った。
前年の課題として、抗体を用いたWestern blot時に、Phos-tag対角線電気泳動の一次元目と二次元目で検出されるパターンの乖離があった。これは、タンパク質の抽出方法の違いにより、Phos-tagがWestern blot時のタンパク質の転写効率又は、抗原抗体反応に影響を与えており、電気泳動時の易動度には違いを与えないことが明らかとなった。この課題を回避・解決するために、タンパク質の抽出方法を統一、また免疫沈降によるタンパク質の濃縮を行った。
次ステップへのサンプル調整として、免疫沈降の条件の最適化を行った。また、リン酸化タンパク質の質量分析を行うためのサンプル調整を行った。
従来のPhos-tag電気泳動では特異度の高い抗体や任意タンパク質の精製・単一化を必要としていたが、本研究により、Phos-tag対角線電気泳動法を用いて通常のWestern blotと同様にPVDF膜にタンパク質を転写し、任意のタンパク質のリン酸化状態を検出することができることが明らかとなった。このことより、細胞や組織由来の多種多様なタンパク質の中から任意のタンパク質の機能的なリン酸化状態を検出及び同定することが可能となった。この技術を利用し現在、タンパク質のリン酸化状態という新しい視点に着目して肥満や糖尿病といった生活習慣病の病態解明につなげようとしている。