2021 Fiscal Year Research-status Report

Generation of African Swine Fever virus-resistant pigs by applying the concept of gene editing technology

Research Project

Project/Area Number	21KK0124
Research Institution	Jichi Medical University
Principal Investigator	谷原史倫自治医科大学, 医学部, 准教授 (90754680)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	下田宙山口大学, 共同獣医学部, 准教授 (40719887) 田中良法岡山理科大学, 獣医学部, 助教 (00747933) 音井威重徳島大学, バイオイノベーション研究所, 教授 (30311814)
Project Period (FY)	2021-10-07 – 2026-03-31
Keywords	アフリカ豚熱 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / ブタ
Outline of Annual Research Achievements	アフリカ豚熱（African Swine Fever: ASF）は家畜豚への驚異的な伝搬力と致死率から世界の養豚業を破壊しうる伝染病であり、現在までワクチンを含む治療法はない。本研究では、ブタの体内に発現させた遺伝子切断酵素Cas9とCas9を標的ゲノム配列に誘導するガイドRNA(gRNA) により侵入してきたウイルスDNAを切断・失活させるという発想のもと、ASFウイルスを標的としたCas9/gRNA発現ブタを作出する。細胞内に発現させたゲノム編集システムにより感染時に侵入してきたASFウイルスDNAを切断し、ASFウイルスの増殖を阻害することで感染防御能を付与する。現在もASFが散発し多数の野生株を保存しているベトナムで２機関と共同研究を行い、ASFウイルス感染抵抗性ブタ系統の作出を試みる。細胞レベルでの感染実験をベトナムで実施するため、まずは日本国内で腎臓あるいは血液より採取した初代ブタマクロファージにSV40LT遺伝子とpTERT遺伝子を組み込んだ不死化ブタマクロファージの作製に着手した。ウイルスベクターを用いてSV40LT遺伝子とpTERT遺伝子を導入する準備は完了し、現在は初代ブタマクロファージの単離を行っている。不死化マクロファージが完成したのちにアフリカ豚熱ウイルスの増殖に必須のCP2475L遺伝子配列を切断するgRNAとCas9を発現する遺伝子改変ブタマクロファージを作製し、細胞レベルでの感染実験へと展開する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason まずは細胞レベルでのアフリカ豚熱感染実験を実施するための細胞株の樹立に着手し、SV40LT遺伝子とpTERT遺伝子のクローニングと配列確認、ウイルスベクターへの組み込み等が完了した。さらに、令和6年度から行うトランスジェニックブタの作出について、胚での顕微注入条件等の予備検討をすでに開始しており、知見を蓄積している。研究はおおむね順調に進展している令和5年度から必要となるベトナムにおける実験系のセットアップだが、現時点ではCOVID-19の感染拡大の影響で実際にベトナムに赴くことができていないものの、この状況を見越して本来の研究計画でも初年度と次年度は主に日本国内で行うことができる研究を中心に構成しており、さらに適宜オンラインミーティングによりベトナム側研究者と研究打ち合わせを行っているため問題はない。
Strategy for Future Research Activity	研究計画の変更は現時点では無く、令和4年度中に不死化ブタマクロファージを作製し、CRISPR/Cas9システム発現コンストラクトを組み込んだうえでベトナムで実際に流行しているアフリカ豚熱野外株を用いた感染実験へと展開する。 COVID-19の感染拡大の影響から、ベトナム・日本両国間での渡航は未だ制限が厳しい。アフリカ豚熱の感染実験を細胞レベル・個体レベルで実施することが本研究の要であるが、日本で樹立した細胞株をベトナムへ輸送する方策により、研究計画通りCOVID-19の影響を最小限に抑えつつ研究を推進していく。
Causes of Carryover	令和3年度ではベトナムへの渡航費用として予算を計上していたが、COVID-19感染拡大の影響により渡航ができず次年度使用額が発生している。情勢を確認しつつ、渡航緩和された時点で次年度使用額も投入して密にベトナムでの研究を推進し、研究に遅延が生じないように留意する計画である。