2010 Fiscal Year Annual Research Report
極微量小分子RNAを網羅的に解析する次世代型核酸アレイチップの開発
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22225003
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
寺前 紀夫 東北大学, 大学院・理学研究科, 教授 (70114569)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西澤 精一 東北大学, 大学院・理学研究科, 准教授 (40281969)
徐 志愛 東北大学, 大学院・理学研究科, 助教 (50562336)
佐藤 雄介 東北大学, 大学院・理学研究科, 助教 (90583039)
山口 央 茨城大学, 理学部, 准教授 (10359531)
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| Keywords | 化学センサー / バイオセンサー / 蛍光リガンド / 核酸 / 光導波路 / miRNA / ナノ細孔 |
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| Research Abstract |
ナノ細孔を検出場とし、脱塩基含有オリゴ核酸と水素結合能を有する蛍光性リガンドなどによる一連の小分子RNAを選択的に且つ高感度に検出する分析法の開発を目指して研究を進めた。小分子RNA検出リガンドとして、蛍光性ジアミノピラジン誘導体(アミロライド)が優れた検出機能を発現しうることを見出した。脱塩基部位RNAプローブを用いた場合、プローブと小分子RNAのハイブリダイゼーションによりRNA二重鎖が形成され、アミロライドはRNA二重鎖に対して解離定数がnMオーダーに達し、極めて高い結合親和力を示すことが分かった。詳細な分光学的および熱力学的解析の結果、A型構造を取るRNA二重鎖に対してアミロライド/脱塩基部位隣接塩基間におけるスタッキング相互作用が効果的に働くことにより、解離定数向上が見られたことを明らかにした。アミロライドを用いることで、発ガンと密接に関連する小分子RNAであるlet-7aを標的とした場合、65fmol(0.45ng)の試料検出が可能である(励起380nm、検出414nm)。また、アミロライドをベースとして蛍光応答特性の改良を進めた結果、疎水場感受性色素DBD基をジアミノピラジン骨格に連結することで、長波長検出(～600nm)に対応した蛍光性リガンドを開発することに成功した。現在、さらにリガンドの検出機能(結合力と蛍光応答特性)の改良を進めている。一方、ナノ細孔をRNAの検出場とするためには、ナノ細孔内部のpHや過冷却といった環境を明らかとする必要がある。
H22年度は、直径が3.1～12nmのシリカナノ細孔内部のpH環境がバルク溶液中と著しく異なり、細孔壁近傍ではバルク溶液のpHに関わらずほぼ中性条件であることを明らかとした。また、直径が3.1nmのシリカナノ細孔内部で過冷却状態が発現することを明らかとした。一方、光導波路分光法に関する研究開発においては、ナノ細孔内部に取り込まれた生体高分子の高感度検出を可能とし、RNA検出への適用性が期待できるようになった。
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