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2011 Fiscal Year Annual Research Report

DNAポリメラーゼζ(ゼータ)の遺伝的改変による遺伝毒性閾値形成機構に関する研究

Research Project

Project/Area Number 22241016
Research InstitutionNational Institute of Health Sciences

Principal Investigator

能美 健彦  国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター, 客員研究員 (30150890)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 増村 健一  国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (40291116)
安井 学  国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 主任研究官 (50435707)
Keywords閾値 / 遺伝毒性発がん物質 / トランスリージョンDNA合成 / DNAポリメラーゼζ / 突然変異
Research Abstract

遺伝毒性に基づいて発がん性を示す遺伝毒性発がん物質には閾値が存在しないと考えられており、どのように低用量であってもヒトに対して発がんリスクを負わせるものとして行政的な規制が行われている。しかし、ヒトには各種の生体防御機能が具備されており、低用量域においては、遺伝毒性が減弱され「事実上の閾値」が形成される可能性がある。本研究では、遺伝毒性(突然変異)誘発に関わるトランスリージョン型DNAポリメラーゼの一つであるDNAポリメラーゼζ(ゼータ)(以下Polζと略)を遺伝的に改変したヒト細胞株およびマウスを作製し、遺伝毒性の閾値形成機構について検討することを目的としている。
平成23年度は、(1)ヒトNalm-6-MSH+細胞を用いて、Polζの2618番目のロイシンをメチオニンあるいはフェニルアラニンに置換したノックイン細胞株L2618MとL2618Fを樹立した。L2618Mは野生型細胞より高い自然突然変異頻度を示し、DNA合成の忠実度が低下していることが示唆された。L2618Mは、benzo[a]pyrene diolepoxide(BPDE)、紫外線(UVC)の突然変異誘発作用に対して、野生型細胞よりも高い感受性を示した。ミスマッチ修復機能を回復させたNalm-6-MSH+株は、ミスマッチ修復能を欠いたNalm-6細胞と同等の遺伝子ターゲティング効率を示した。 (2)C57BL/6マウスを遺伝的背景にして、Polζの2610番目のロイシンをメチオニンに置換したノックインマウス(L2610M)と2771番目のチロシンをフェニルアラニンに置換したノックインマウス(Y2771F)のES細胞を樹立した。マウスPolζのL2610MはヒトPolζのL2618Mに対応しPolζのDNA合成の忠実度が低下し、Y2771FではDNA合成活性が低下していると考えられる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、遺伝毒性発がん物質の閾値形成機構におけるDNAポリメラーゼζ(Polζ)の役割を明らかにすることを目的としており、Polζを遺伝的に改変したヒト細胞株、ノックインマウスを樹立し、遺伝毒性物質に対する感受性を、低用量域において、野生型細胞、野生型マウスと比較する。ヒト細胞は一般に遺伝子ターゲティング効率が低いと言われているが、本研究で用いるNalm-6株は、例外的に高いターゲティング効率を示す。平成23年度は、ミスマッチ修復機能を回復させたNalm-6-MSH+細胞を用い、PolζのDNA合成における忠実度を支配すると考えられるロイシン2618をメチオニンあるいはフェニルアラニンに置換した細胞株(L2618M, L2618F)を作出することをめざし、両細胞株の樹立に成功した。L2618Mの自然突然変異頻度は野生型細胞よりも上昇しており、予想通りDNA合成の忠実度が低下していることを示唆した。また、ヒトのL2618Mに対応するマウスPolζを発現するノックインマウス(L2610M)およびPol活性が減弱したノックインマウス(Y2771F)の樹立をめざし、そのES細胞を樹立した。しかし、ES細胞を作製する過程で、遺伝子導入を確認するためのサザン解析の実験条件等を変更する必要が生じたため、平成23年度予算のうち300万円を24年度に繰り越した。平成23年11月には、参加者約200名を得て、東京において「第二回遺伝毒性発がん物質の閾値に関する国際シンポジウム」を開催し、研究成果を発表した。ES細胞の樹立に時間を要したものの、ヒト細胞の研究は予定通りに進んでおり、マウスについても計画通り2種類のES細胞が樹立できたことから、これらまでの研究はおおむね順調に進捗していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成24年度は、ヒトPolζのDNA合成活性が減弱したD2781N細胞、PolζのDNA合成の忠実度が低下したL2618M細胞の臭素酸カリウムに対する感受性を、TK遺伝子突然変異、in vitro小核形成、姉妹染色分体交換を指標に比較検討する。特に、低用量域での用量効果曲線を詳細に検討することで、閾値形成におけるPolζの役割について検討する。臭素酸カリウムは、小麦粉の改良剤として、最終製品には残存しないことを条件に現在も食品添加物としての使用が認められているが、ラットに飲水投与すると腎臓に酸化DNA損傷を誘発し、腫瘍を形成する。臭素酸カリウムをはじめとする酸化損傷遺伝毒性物質に関して閾値が存在するかは議論の多いところであり、樹立したヒト細胞株での結果は、国際的に注目されている。マウスに関しては、樹立した2種のES細胞からキメラマウスさらにヘテロF1マウスの樹立を試みる。平成24年7月に英国で開催される英国環境変異原学会(UKEMS)のシンポジウムにおいて、遺伝毒性発がん物質の閾値に関する招へい講演を行う予定である。また平成24年11月にスイスで開催されるスイス・トキシコロジー学会において福島原発事故との関連で低用量放射線および低用量発がん物質のリスク評価について招へい講演を行う予定である。

  • Research Products

    (31 results)

All 2012 2011

All Journal Article (10 results) (of which Peer Reviewed: 10 results) Presentation (21 results) (of which Invited: 2 results)

  • [Journal Article] Comparison of the mutagenicity of aristolochic acid I and aristolochic acid II in the gpt delta transgenic mouse kidney2012

    • Author(s)
      G. Xing
    • Journal Title

      Mutat. Res.

      Volume: 743 Pages: 52-58

    • DOI

      10.1016/j.mrgentox.2011.12.021

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Embryonic lethality in mice lacking mismatch-specific thymine DNA glycosylase is partially prevented by DOPS, a precursor of noradrenaline2012

    • Author(s)
      Y. Saito
    • Journal Title

      Tohoku J.Exp.Med

      Volume: 226 Pages: 75-83

    • DOI

      10.1620/tjem.226.75

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Comprehensive toxicity study of safrole using a medium-term animal model with gpt delta rats2011

    • Author(s)
      M. Jin
    • Journal Title

      Toxicol.

      Volume: 290 Pages: 312-321

    • DOI

      10.1016/j.tox.2011.09.088

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Chemopreventive effects of silymarin against 1,2-dimethylhydrazine plus dextran sodium sulfate-induced inflammation-associated carcinogenicity and genotoxicity in the colon of gpt delta rats2011

    • Author(s)
      N. Toyoda-Hokaiwado
    • Journal Title

      Carcinogenesis

      Volume: 32 Pages: 1512-1517

    • DOI

      10.1093/carcin/bgr130

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Involvement of mismatch repair proteins in adaptive responses induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine against gamma-induced genotoxicity in human cells2011

    • Author(s)
      A. Yamamoto
    • Journal Title

      Mutat. Res.

      Volume: 713 Pages: 56-63

    • DOI

      10.1016/j.mrfmmm.2011.05.014

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Site-specific in vivo mutagenicity in the kidney of gpt delta rats given a carcinogenic dose of ochratoxin A2011

    • Author(s)
      D. Hibi
    • Journal Title

      Toxicol.Sci

      Volume: 122 Pages: 406-414

    • DOI

      10.1093/toxsci/kfr139

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Acrylamide genotoxicity in young versus adult gpt delta male rats2011

    • Author(s)
      N. Koyama
    • Journal Title

      Mutagenesis

      Volume: 26 Pages: 545-549

    • DOI

      10.1093/mutage/ger014

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Mutational specificities of brominated DNA adducts catalyzed by human DNA polymerases2011

    • Author(s)
      A. Sassa
    • Journal Title

      J.Mol.Biol

      Volume: 406 Pages: 679-686

    • DOI

      10.1016/j.jmb.2011.01.005

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Strategies in case of positive in vivo results in genotoxicity testing2011

    • Author(s)
      V. Thybaud
    • Journal Title

      Mutat. Res.

      Volume: 723 Pages: 121-128

    • DOI

      10.1016/j.mrgentox.2010.09.002

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Antigenotoxic effects of p53 on spontaneous and ultraviolet light B-induced deletions in the epidermis of gpt delta transgenic mice2011

    • Author(s)
      K. Masumura
    • Journal Title

      Environ. Mol. Mutagen.

      Volume: 52 Pages: 244-252

    • DOI

      10.1002/em.20610

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] in vivo mutagenesis: its analysis and underlying mechanisms2012

    • Author(s)
      T. Nohmi
    • Organizer
      6th International Conference on Environmental Mutagens in Human Populations
    • Place of Presentation
      Doha, Qatar
    • Year and Date
      20120326-20120329
    • Invited
  • [Presentation] Identification of genomic insertion sites of λEG10 DNA in gpt delta transgenic mice and rats by high-throughput DNA sequencing2012

    • Author(s)
      T. Nohmi
    • Organizer
      51st Annual Meeting of Society of Toxicology
    • Place of Presentation
      San Francisco, U.S.A.
    • Year and Date
      20120311-20120315
  • [Presentation] Spontaneous point mutations and deletions accumulate in a different manner with aging of gpt delta transgenic mice2012

    • Author(s)
      K. Masumura
    • Organizer
      51st Annual Meeting of Society of Toxicology
    • Place of Presentation
      San Francisco, U.S.A.
    • Year and Date
      20120311-20120315
  • [Presentation] Evaluation of in vivo genotoxicity induced by N-ethyl-N-nitrosourea, benzo[a]pyrene and 4-nitroquinoline-1-oxide by Pig-a and gpt assays2012

    • Author(s)
      K. Horibata
    • Organizer
      51st Annual Meeting of Society of Toxicology
    • Place of Presentation
      San Francisco, U.S.A.
    • Year and Date
      20120311-20120315
  • [Presentation] 転写と共役したDNA修復機構を欠損する紫外線高感受性症候群の原因遺伝子の同定2011

    • Author(s)
      張 雪
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      20111213-20111216
  • [Presentation] 転写と共役したDNA修復機構においてUVSSAとUSP7は協調的にCSBを安定化する2011

    • Author(s)
      西条将文
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      20111213-20111216
  • [Presentation] 酸化的損傷を持つDNAを乗り越える際の損傷乗り越えDNAポリメラーゼの役割2011

    • Author(s)
      鈴木哲矢
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      20111213-20111216
  • [Presentation] 次世代シークエンサーを用いた大腸菌ミューテーター株のゲノムに蓄積する突然変異の解析2011

    • Author(s)
      山田雅巳
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      20111213-20111216
  • [Presentation] Genotoxic thresholds: identification of mutations in vivo and mechanistic studies in vitro,2011

    • Author(s)
      T. Nohmi
    • Organizer
      2nd International Symposium on Genotoxic and Carcinogenic Thresholds
    • Place of Presentation
      Tokyo, Japan
    • Year and Date
      20111123-20111123
    • Invited
  • [Presentation] 8-クロログアニンDNA付加体を含むオリゴマーの構築とその誤塩基対形成機構に関する研究2011

    • Author(s)
      安井 学
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] ハイ・スループット微生物遺伝毒性試験法の検討72011

    • Author(s)
      須井 哉
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] F344系gpt deltaラットの6ヶ月飼育試験による背景データの取得2011

    • Author(s)
      高木久宜
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] gpt deltaマウスの加齢に伴う点突然変異および欠失変異の蓄積2011

    • Author(s)
      増村健一
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] Pig-aアッセイとトランスジェニック突然変異試験の組合せに関する研究2011

    • Author(s)
      堀端克良
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] マウスをモデルとした、高頻度に発生する生殖系列突然変異が次世代以降の個体に与える影響の解析2011

    • Author(s)
      内村有邦
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] 大気汚染物質によるgpt deltaマウス肺中の突然変異とヒト肺がん組織中p53遺伝子の突然変異の比較2011

    • Author(s)
      青木康展
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] 忠実度ないし活性を低下させたDNAポリメラーゼζを発現するヒト細胞株の樹立と遺伝毒性物質に対する感受性2011

    • Author(s)
      鈴木哲矢
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] DNAポリメラーゼκ遺伝子改変ヒト細胞を用いた遺伝毒性物質に対する感受性の検討2011

    • Author(s)
      兼丸祐紀
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] MitomycinCによるDNA二本鎖切断の誘発に対するDNA polymerase κの役割2011

    • Author(s)
      本山茂樹
    • Organizer
      日本環境変異原学会第40回大会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      20111121-20111122
  • [Presentation] gpt deltaトランスジェニックマウス由来初代培養肝細胞を用いることで薬物代謝活性を考慮したin vitro遺伝毒性試験2011

    • Author(s)
      堀端克良
    • Organizer
      第70回日本癌学会学術総会
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      20111003-20111005
  • [Presentation] Critical roles of mismatch repair proteins in modulation of genotoxicity of gamma-irradiation in human cells by pretreatments with N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine at low doses2011

    • Author(s)
      T. Nohmi
    • Organizer
      14th International Congress of Radiation Research
    • Place of Presentation
      Warszawa, Poland
    • Year and Date
      20110828-20110901

URL: 

Published: 2014-07-24  

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