2011 Fiscal Year Annual Research Report
ナイロンオリゴマー分解酵素(NylABC)の分子設計と物質生産への応用
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22360350
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
根来 誠司 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (90156159)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (40236443)
加藤 太一郎 兵庫県立大学, 大学院・工学研究科, 助教 (60423901)
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| Keywords | ナイロンオリゴマー / 6-アミノカプロン酸 / 6-Aminohexanoate oligomer / 加水分解酵素 / X線結晶構造解析 / Arthrobacter / ω-ラウロラクタム / ε-カプロラクタム |
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| Research Abstract |
ナイロンの再資源化においては、副産物の原料への変換が重要な検討課題である。ナイロンオリゴマー分解菌Arthrobacter sp.KI72株が生産する6-アミノカプロン酸環状2量体(Acd)加水分解酵素(NylA)は、Acdに極めて特異性が高く、ε-カプロラクタム、6-アミノカプロン酸直鎖状2量体(Ald)には殆ど活性を示さない。これまでの研究により、Ser174,cisSer150,Lys72が触媒残基であることが分かっている。本年度はAcdの2カ所のアミド結合の内、加水分解を受けない側のアミド結合近傍に位置するAsn125,Cys316の変異体を用いて、Ald及び炭素数の異なる環状アミド(ω-ラウロラクタム,ω-オクタラクタム,ε-カプロラクタム)に対する分解機能を検討した。
変異型NylA発現株から粗酵素液を調製し、陰イオンクロマトグラフィーで精製後、Aldと各ラクタムの分解活性を測定した。その結果、Ald分解活性は、N125D,C316Dの2酵素では親型NylAに比べて40～60倍上昇することを見いだした。また、触媒効率(kcat/km)は60～70倍上昇し、125位、316位のAsp置換は新たにNylB機能を付与すると推定した。ε-カプロラクタム、ω-オクタラクタム分解活性は微弱であるものの、316位がPhe,Leu型の変異酵素で活性の付与・強化が示された。
一方、ω-ラウロラクタムに対する活性はC316L変異により、親型酵素の3倍に上昇したが、C316F変異により3%まで低下した。酵素・基質複合体の立体構造から、本酵素の基質認識について考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NylAの基質認識部位を構造から同定後、アミノ酸置換を行った。その結果、これまで活性が検出されなかった、6アミノ酸直鎖2量体、εカプロラクタム、ωラウロラクタムなどの新たな基質に対する活性を、計画的に増強することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成22～23年度は、主としてNylA、NylB酵素の検討を行った。そこで、今後はNylCについての解析を実施する。特に、酵素・基質複合体の構造解析は、酵素高機能化のために重要である。しかし、NylCは自己分断とその後のタンパク質構造変化により活性酵素型酵素を生じるという特徴を有する。従って、酵素・基質複合体の調製には、1)自己分断が起こり、且つ基質を分解しない変異酵素の取得、2)基質アナログの合成、3)結晶へのパルス的な基質ソーキング操作が必要である。これらの問題を解決後、複合体の構造解析を行い、得られた知見をもとに、酵素機能を改良する。
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[Journal Article] Three-dimensional structure of nylon hydrolase and mechanism of nylon-6 Hydrolysis2012
Author(s)
S.Negoro, N.Shibata, Y.Tanaka K.Yasuhira, H.Shibata, H.Hashimoto, Y.-H Lee, S.Oshima, R.Santa, S.Oshima, K.Mochiji, Y.Goto, T.Ikegami, K.Nagai, D.Kato, M.Takeo, Y.Higuchi
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Journal Title
Journal of Biological Chemistry
Volume: 287
Pages: 5079-5090
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] ナイロンオリゴマー分解酵素(NylC)の高度耐熱化2011
Author(s)
三田隆二, 田中優佑, 永井圭介, 柴田直樹, 李映昊, 加藤太一郎, 武尾正弘, 樋口芳樹, 後藤祐児, 根来誠司
Organizer
第63回日本生物工学会大会
Place of Presentation
東京農工大学小金井キャンパス(東京都)(2Dp14(口頭発表))
Year and Date
20110926-20110928
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[Presentation] 耐熱化NylCによる6ナイロンの酵素分解2011
Author(s)
永井圭介, 田中優佑, 三田隆二, 大嶋渉平, 井内健輔, 加藤太一郎, 武尾正弘, 持地広造, 根来誠司
Organizer
第63回日本生物工学会大会
Place of Presentation
東京農工大学小金井キャンパス(東京都)(2Dp15(口頭発表))
Year and Date
20110926-20110928
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[Presentation] アミド化合物の酵素合成:高効率触媒の形成要件2011
Author(s)
小林達也, 中田悠介, 馬場剛史, 河島康之, 柴田直樹, 加藤太一郎, 武尾正弘, 樋口芳樹, 重田育照, 松井亨, 神谷克政, 根来誠司
Organizer
第63回日本生物工学会大会
Place of Presentation
東京農工大学小金井キャンパス(東京都)(3Da01(口頭発表))
Year and Date
20110926-20110928
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[Presentation] ナイロンオリゴマー分解酵素NylBの基質認識機構2011
Author(s)
西口拓紀, 中田悠介, 小林達也, 河島康之, 重田育照, 馬場剛史, 神谷克政, 武尾正弘, 加藤太一郎, 根来誠司
Organizer
第63回日本生物工学会大会
Place of Presentation
東京農工大学小金井キャンパス(東京都)(3Da02(口頭発表))
Year and Date
20110926-20110928
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