コドン認識を拡張する修飾塩基の構造生物学的解析

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22510242
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 竹本 千重 独立行政法人理化学研究所, システム研究チーム, 上級研究員 (40306527)
• Keywords: リボソーム / X線結晶構造解析 / tRNA / コドン認識 / tRA Ile2 / タンパク質合成

Research Abstract

今年度は、結晶化に適したリボソームの調製方法を確定することと、tRNAやmRNAの配列のバリエーションによって、微調整は必要となるが、リボソーム複合体の結晶化条件を、ある程度絞り込ことに注力した。
1.高分解能データが期待できるリボソームの調製法の検討
前年度の結晶化スクリーニングによって、70Sリボソームの調製条件を検討したところ、複数の調製法によって得られたリボソームを用いた結晶から、10A程度の回折データ取得することができた。そこで、今年度は、粗リボソーム画分調製(3通り)、70Sリボソーム精製第一段階(2通り)、第二段階(2通り)の3ステップに分けて、それぞれの精製法・溶液条件を組み合わせてリボソームを調製し、得られた結晶の反射データの良し悪しに基づいて、条件を絞り込んでいった。現在、70Sリボソーム調製方法については、条件を確定した。調製後のリボソームを保存する前処理については、まだ反射データの違いまで判別できていないので、複数の方法を平行して試行している。
2.リボソーム-tRNA-mRNA複合体の結晶化条件検討とmRNAの設計
まず、アンチコドン全体の構造を確実に同定するために、70SリボソームのP部位にtRNAが結合した複合体(P-site complex)の結晶化を行った。mRNAには、SD配列、スペーサー、P-siteコドン、A-siteコドンを配置した。検討の結果、スペーサーの長さは、5塩基とした。得られた結晶のX線回折データから、E-siteのmRNAの配列にcongnateなtRNAを加えた方が、分解能が高い傾向があることが分かった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

23年度は、高分解能データ収集が期待できるリボソームの結晶作成に注力したので、tRNAについては精製方法を確立した段階で留まっており、大量調製・精密解析には至っていない。しかし、リボソーム・mRNA・tRNAを含むP-site complexの結晶化手順は、ほぼ確立できた。

Strategy for Future Research Activity

研究計画に大きな変更はない。
1)tRNA(Ile)の大量調製を行い、修飾塩基を含む精密質量分析を依頼すると共に、アミノアシルtRNA合成酵素を用いて速度論的解析を行う。修飾レベルの異なるtRNAが得られた場合は、既知の修飾酵素であれば、同様の酵素学的分析を行い、いったん論文にまとめる。
2)P-site complexは、年内のデータ収集を目指す。同時に、EF-Tu/Ile-tRNA/GMPPNP複合体を用いて、A/T-site complexの結晶化も試みる。