2012 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト由来ＰＧＤ合成酵素の金属イオンによる活性化機構解明のための中性子線構造解析
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22550152
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
井上 豪 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (20263204)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 浩由 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30324809)
溝端 栄一 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90571183)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | 中性子線構造解析 / プロスタグランジンＤ合成酵素 / 反応メカニズムの解明 / 結晶の大型育成 |
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| Research Abstract |
造血器型プロスタグランジン（PG）D合成酵素（H-PGDS）が補酵素グルタチオン(GSH)存在下でアレルギー物質であるPGD2を産生する際、2量体の中心に結合したMg2+はGSHのKm値を約4倍も向上させ、酵素を活性化することが知られている(Nat. Struct. Mol. Biol., 2003)。本研究課題では、ヒト由来H-PGDSの中性子線解析を成功させ、2量体の中心に存在するMg2+によってそれぞれのプロトマーごとに補酵素として結合するGSHのSH基をチオラート化する分子機構を直接観察によって明らかとし、2量体間のヘテロな構造も明らかとして、Mg2+による協奏的な活性化機構も解明することを目的としている。
中性子線解析を成功させるためには、通常 1 mm角以上の高品質で大型の結晶を得る必要があり、高純度サンプルの精製および大型結晶化を繰り返し行った。特に種結晶化による大型化を試みたが、最大で 0.3×0.4×1.1 mmを超える良質で大型の結晶育成には成功しなかった。一方で、以前、ソユーズを使った宇宙実験を試み、ゲルチューブ法を用いた結晶化を試み、Native結晶について1.28Å分解能、阻害剤複合体に関しては1.05Å分解能でのＸ線回折強度測定に成功している。マキシマムエントロピー（MEM）法による構造精密化を終了し、これまでに見られなかった水和構造について明らかとなった（in preparation）。しかし、活性中心のチオラートは放射光によるX線損傷によって酸化され、本来の活性型の構造ではなかった。
一方、本研究課題を推進する過程で、ゲルを使った結晶核の発生方法や、溶液撹拌技術と組み合わせた大型結晶育成実験などを試み、新たな結晶化方法の開発に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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