高等植物の相同組換えによる遺伝子ターゲティングの頻度を向上させる組換え系の開発

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22570049
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 定塚 恵世(久富恵世) 静岡県立大学, 融合科学研究科(研究院), その他 (60517887)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野口 博司 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (60126141)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2013-03-31
• Keywords: 遺伝子ターゲティング / 相同組換え / 変異導入 / 植物 / イネ / 形質転換 / バイオテクノロジー / 遺伝子

Research Abstract

ゲノム配列を自在に改変できる遺伝子ターゲティングは、ゲノム配列が明らかとなった生物で早急に求められている手法であるにも関わらず、高等植物では特に遅れており、相同組換えを用いたゲノム改変法の確立と普及が急務である。申請者らは、世界に先駆けて穀物のモデル植物であるイネのゲノムを改変し思い通りの変異体を作出してきたが、ターゲティング頻度が低いため、大規模な実験と材料が必要であった。そこで本研究課題では、高等植物のターゲティングの汎用化を目指し、ターゲティング時の正確な組換え機構を理解し、適切な組換え酵素（λRed系）を一過的に発現させてターゲティング頻度を飛躍的に増加させることを目的とする。さらに、ターゲティング頻度を簡便に測定するためのアッセイ用ベクターも構築し、ターゲティング頻度をさらに向上させることが可能な最適ベクターの構築も試みることも目的である。
今年度は、昨年度λRed系酵素を発現させるためのプラスミドを用いてイネに形質転換し、λRed系酵素を発現したイネの作出に成功したのでトランスジェニックイネの育成を行った。また、アッセイ用ベクターには特定の点変異が導入されると除草剤耐性となる変異型ALS遺伝子を用いて、ポジティブ・ネガティブ選抜が可能で、アグロバクテリア菌による植物への形質転換も可能な、バイナリーベクターを構築することに成功した。最適な相同領域の長さを決定するため、ネガティブマーカーの内側に、12 kb、9 kb、6 kb、3 kb、1.7 kbの５種の長さのALS遺伝子領域を持つバイナリーベクターを作成し、それぞれを複数回イネカルスに形質転換した。得られた形質転換体の一部は再生個体を得てさらに解析を進めている。今後の課題としてはλRed系酵素を発現したイネ由来のカルスでターゲティング頻度を解析することである。

Current Status of Research Progress

Reason

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。