2011 Fiscal Year Annual Research Report
26Sプロテアソームの低分解能結晶構造解析による分子様態に関する研究
| Project/Area Number |
22570113
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
森本 幸生 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (80200450)
|
|---|
| Keywords | プロテアソーム / X線結晶構造解析 / 分子動態 |
|---|
| Research Abstract |
出芽酵母PRE6-RPT1融合株YYS676およYYS1235株の大量培養を行い、26S粒子を含む精製試料を得て結晶化を行った。微結晶は得られるものの中分解能(約4A)を与える結晶は得られなかった。熱安定性のある耐熱性酵母からの26S試料の遺伝子改変による作成、精製を進めた。これの20Sおよび26Sプロテアソームも上記手法と同様に精製、結晶化を行い20Sについて回折データを得て解析を進めた。現在耐熱性の鍵となる構造について20S粒子の立体構造比較などを行っている。
26S全体粒子の両端に結合している19S調節因子の結合状態・形状を解析するため、YYS676株からの26S粒子の精製を行った。溶液散乱試料用に、上記と同様の精製方法およびゲルろ過により、26S全体部分と調節因子(蓋部領域)の試料を得て溶液散乱測定を行った。26S全体粒子の全長および形状の解析を進めた。これにより20S両端に19S基底都蓋部が結合した非対称概念モデルを解析した。さらに本酵素め基質であるユビキチン化蛋白質の大腸菌による発現系を使い、分解される蛋白質部分の調製を行って、分解複合体の調製を進めた。この試料を溶液散乱とともに原子間力顕微鏡による形態解析に利用する準備とした。さらに20S触媒部分のみの溶液散乱測定と形状解析を行って、この方法による分解過程の追跡手法を検討した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
低分解能解析といえども結晶データが必要であり、現在4A程度の分解能を与える良質の結晶が得られていない。またデータ収集も一部のみであり、位相改良に必要な回折反射数に至っていない。溶液散乱からの形状解析は比較的順調であるため、これを用いた解析を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
残り研究期間を全体粒子解析のための、原子間力顕微鏡像の取得および溶液散乱法による形状解析に重点を移し、現在保有している回折データを用いることで、当初計画した低分解能全体粒子解析を目指す。
|
