2010 Fiscal Year Annual Research Report
マウス由来GDEファミリータンパク質の立体構造と作用機構の解明
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22570117
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
青山 浩 大阪大学, 薬学研究科, 准教授 (60291910)
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| Keywords | 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 脂質代謝 / リン脂質 |
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| Research Abstract |
グリセロホスホジエステル ホスホジエステラーゼ(GDE:EC.3.1.4.46)は細胞膜のリン脂質がホスホリパーゼによって脱アシル化反応を受けて生じたグリセロホスホジエステルをアルコールとグリセロール-3-リン酸に加水分解する酵素である。可溶性酵素である細菌のGDEは、古くから多くの研究がなされている。近年哺乳類のGDEの存在がようやく確認され、ヒトやマウスには少なくとも7種類の酵素が存在することが明らかとなっている。また、マウスではGDE5以外は膜貫通タンパク質であると予測されている。
GDEファミリータンパク質の中で2回膜貫通タンパク質であるGDE1のcDNAのC末端にヒスチジンタグを付加し、昆虫細胞(Sf9)にバキュロウイルスを用いて発現させた後、ニッケルカラムとゲルろ過カラムにより精製を行った。沈殿剤、界面活性剤などの種類・濃度といった条件検索の結果、再現性よく柱状結晶が得られる条件を見つけ出した。しかしながら精製標品は数日で結晶化能を消失したため、カラムクロマトグラフィーによる精製方法の再検討を行った。
結晶を凍結させる不凍剤にグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールなど使用頻度の高い化合物を用いると、ダメージが認められた。そこで、オイルを不凍剤として用いることにし、Paraton-N、流動パラフィン、シリコンオイルを単独もしくは混合させて、結晶凍結を行った。凍結結晶を大型放射光施設SPring-8の大阪大学蛋白質研究所ビームライン(BL44XU)に持ち込んで、X線回折実験を行った。
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