2012 Fiscal Year Annual Research Report
マウス由来ＧＤＥファミリータンパク質の立体構造と作用機構の解明
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22570117
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
青山 浩 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (60291910)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / 脂質代謝 |
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| Research Abstract |
グリセロホスホジエステル ホスホジエステラーゼ（GDE：EC.3.1.4.46）は細胞膜のリン脂質がホスホリパーゼによって脱アシル化反応を受けて生じたグリセロホスホジエステルをアルコールとグリセロール-3-リン酸に加水分解する酵素である。近年、哺乳類でもGDEの存在が発見され、ヒトやマウスには少なくとも７種類（GDE1～GDE7）存在することが確認されている。
膜貫通タンパク質であるGDE1、GDE4及びGDE7、可溶性タンパク質で分子量６万５千のGDE5の発現・精製に成功し、そのうち２回膜貫通タンパク質GDE1のX線結晶構造の解明を目指して諸条件の検討を行った。マウスGDE1のC末端にヒスチジンタグを結合させて昆虫細胞(sf9細胞）にバキュロウイルスを用いて発現させ、得られた膜画分を各種界面活性剤を用いて可溶化させた。その結果、酵素の可溶化の際に用いる界面活性剤としてはドデシルマルトシドの使用が最適であることをゲル濾過クロマトグラム、電気泳動法及び動的光散乱法で確認した。
得られた精製標品を用いて結晶化条件の検索を行ったところ、沈殿剤にJeffamineを用いることで、複数の条件で結晶が得られることが明らかとなった。 またGDE1の酵素活性には、マグネシウム、コバルト、マンガンといった二価陽イオンが必須であることを明らかにし、そのうちマグネシウムイオン存在下での結晶作製にも成功した。これらの結晶を大型放射光施設SPring-8にてX線回折データ収集を行い3Å分解能のX線回折データの収集に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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