2010 Fiscal Year Annual Research Report
新規コアクチベーターNF複合体の構成因子と制御機構の解析
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22570168
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
久武 幸司 筑波大学, 大学院・人間総合科学研究科, 教授 (70271236)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 綾 筑波大学, 大学院・人間総合科学研究科, 助教 (50436276)
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| Keywords | RNA結合タンパク質 / 転写 / コアクチベーター / クロマチン免疫沈降 / ガン遺伝子 |
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| Research Abstract |
NF45、NF90及びNF110にFLAGタグを付けたcDNAを使用して、各因子を安定的に発現するHeLa細胞株を作製した。細胞株を大量培養し、得られた核抽出液を分画すると、NF45、NF90及びNF110の分布が内因性のもとの異なっており、アミノ末端のFLAGタグが原因でNF複合体の性質が変化した可能性があることが分かった。現在NF各タンパク質のカルボキシ末端にFLAGタグを付けたHeLa細胞株の作製に取りかかっている。
一方、各NFタンパク質を大量発現後に精製を行い、抗血清を作製した。抗血清を抗原カラムで精製し、ウェスタンブロットやクロマチン免疫沈降に使用できることが確認でき、この抗体を用いてc-fos上での動態を解析した。細胞を無血清下で培養後に、クロマチン免疫沈降を行った結果、NF複合体はc-fos遺伝子のプロモーターからエンハンサーの領域に存在するが、c-fos遺伝子内部にはほとんど存在しないことが分かった。つぎに、血清添加でc-fos遺伝子を誘導すると、c-fos遺伝子のプロモーターからエンハンサーの領域のみならず、c-fos遺伝子内にもNF複合体が存在することが分かった。遺伝子内部のNF複合体の結合はRNAポリメラーゼIIの結合と強く相関し、NF複合体がRNAポリメラーゼIIと一緒に挙動していることが示唆された。また、抗体で内在性のNF複合体を免疫沈降すると、複数個のタンパク質がNF複合体と結合していることが再確認できた。
NFタンパク質をsiRNAにてノックダウンを試み、数個のsiRNAをテストした結果、NF90とNF110を効率よくノックダウンできた。NF90とNF110のタンパク量が低下すると、NF45の量も低下し、NF45はNF90またはNFI10と複合体を形成して、安定化していることが分かった。
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