2010 Fiscal Year Annual Research Report
感染応答タンパク質の高度保存のための酸素バブリング・アルデヒド新規免疫電顕固定法
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22580048
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
朴 杓允 神戸大学, 農学研究科, 教授 (20147094)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 健一 神戸大学, 農学研究科, 助教 (40437504)
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| Keywords | 酸素バブリング固定 / 感染応答蛋白質 / 糖蛋白質 / グルタルアルデヒド固定 / 微細構造 / 冠根 / トルイジン / 液胞 |
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| Research Abstract |
グルタルアルデヒド(GA)による3種のタンパク質(アルブミン,カゼイン、ゼラチン)に対するin vitro固定を最初に調査した。リン酸緩衝化したGA液にタンパク質を添加して、GAとタンパク質との間の反応生成量を分光光度的に解析すると、タンパク質はGAと反応して15分以内に沈殿した。この際、GA液で急激な酸素の消費が伴うことが分かった。酸素バブリング処理と酸素無処理したコムギ葉から電子顕微鏡試料を作製し、コムギ葉ブロックから厚切り切片を作製してトルイジン青で染色した。切片の光顕観察の結果、酸素バブリング処理葉の液胞は無酸素処理のそれよりトルイジン青に濃染した。トルイジン青は粗面小胞体、軟骨基質、細胞核を良く染めるため、その好染部位にはタンパク質、特に糖タンパクが多量に局在していると評価できる。この結果は固定中の酸素バブリングは細胞の糖タンパクの保存に優れた効果を示すことが分かった。1.5時間の酸素バブリング処理したコムギ葉細胞を電顕観察により、液胞の無定形成分の高度保存と液胞膜コントラストの増加を確認した。本研究は植物病害の感染応答時に病原菌から分泌される糖タンパクの免疫電顕保存を目指すものである。菌の分泌する糖蛋白質は生産量が少ないため、電顕下での捕捉はやや困難と考えられるため、当面の標的物質を冠根から多量に分泌される粘液性糖タンパクに絞った。冠根粘液の組織細胞内の保存を指標にして固定液の溶存酸素量を計測しつつGA固定を行い試料作製した。その結果、植物根に接触して30秒以内にGA前固定液中の溶存酸素は減少し、15分以内に最低レベルまで減少した。生物組織のGA固定は通常1～4時間くらいであるが、酸素バブリングGA固定では30分以内に終了できることが分かった。
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