組換えニホンウナギ生殖腺刺激ホルモンの産生および卵形成における機能解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22580219
• Research Institution: Fisheries Research Agency
• Principal Investigator: 風藤 行紀 独立行政法人水産総合研究センター, 養殖研究所生産技術部, 研究員 (60399996)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玄 浩一郎 独立行政法人水産総合研究センター, 養殖研究所生産技術部, 主任研究員 (80372051)
• Keywords: 水産学 / ウナギ / 生殖生理 / バイオテクノロジー

Research Abstract

生殖腺刺激ホルモン(GTH)は脊椎動物を通して配偶子形成の主要な調節因子であり、有用動物の成熟統御に頻繁に用いられる。これまでの研究で2種のGTH(濾胞刺激ホルモン:FSHおよび黄体形成ホルモン:LH)の存在が知られているが、魚類では両GTHの詳細な機能については殆ど分かっていない。そこで、本研究では重要水産対象種であるニホンウナギをモデルとして、本種の組換えFSHおよびLHを用いて、これらの卵形成における機能を調べると共に、同ホルモンの魚類成熟統御への応用を検討する。
ウナギFSHおよびLHを構成する共通のαアブユニット(GpHα)およびホルモン特異的βサブユニットの遺伝情報を基に発現ベクターを構築、ヒト腎臓293細胞に導入して、組換えFSHおよびLHを発現させた。また、タンパク質の生体内寿命の延長化に関与するヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのC末端糖鎖結合部位(CTP)を挿入したFSHおよびLHも同様に発現させた。これら組換えGTHの産生量は5-10mg/L-培養液と概ね高い値を示した。
次に、各ウナギGTHの力価の算定をウナギFSHおよびLHに対する受容体を用いたレポーターアッセイにより調べた。その結果、FSH、LH共に、10-30ng/ml程度で対応する受容体を活性化した。また、CTPを挿入しても、そのホルモン活性に影響を与えないことが示された。
上記の方法で発現させた組換えウナギGpHαを家兎に免疫し、ポリクロナール抗体(抗GpHα)を作製した。次に、抗GpHαの特異性を非変性下および変性還元下のウェスタンブロットにより調べた。その結果、作製された抗体が各条件下で特異的に抗原を認識していることが確認された。本抗体と、これまでに作製してきた各βサブユニットに対する抗を併せて用いることで、ウナギGTHの特異的な測定系の確立が可能になると考えられる。