2010 Fiscal Year Annual Research Report
魚類への酸化ストレスに伴う抗酸化酵素の発現制御機構-分子細胞生物学的アプローチ-
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22580224
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
長富 潔 長崎大学, 水産学部, 教授 (40253702)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原 研治 長崎大学, 水産学部, 教授 (10039737)
小田 達也 長崎大学, 水産学部, 教授 (60145307)
金井 欣也 長崎大学, 水産学部, 教授 (40145222)
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| Keywords | 抗酸化酵素 / プロモーター / 酸化ストレス / 魚病細菌 / 細胞培養系 |
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| Research Abstract |
本研究では分子細胞生物学的手法を用い、ヒラメ抗酸化酵素遺伝子の制御領域の解析並びに関連する転写因子を探索すること、次いでヒラメマクロファージの細胞培養系によってEdwardsiella tarda (E.tarda)暴露に伴う酸化ストレスに対する抗酸化酵素の発現制御機構を明らかにすることを目的とした。
先ず、E.tarda暴露に伴う生体側の抗酸化酵素の一つであるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の応答機構を分子レベルで明らかにするためには、SODの遺伝情報を得る必要がある。そこでヒラメCu,Zn-SOD及びMn-SOD遺伝子のcDNAクローニングを行った。先ず、ヒラメ肝膵臓より両SODを単離精製し、自動エドマン分解法により両酵素のN末端アミノ酸配列を決定した。また、その情報に基づいてデザインしたプライマーを用いてRT-PCR、5'-RACE及び3'-RACBにより得られた増幅産物のTAクローニングを行い、塩基配列を決定した。その結果、両SOD cDNAの全塩基配列及び演繹アミノ酸配列(全一次構造)が明らかになった。
次いで両SODの遺伝子情報を基にデザインしたプライマーを用いて、E.tarda暴露に伴うヒラメSODの挙動をmRNAレベルで調べた。その結果、E.tarda暴露後、強毒株、弱毒株共にヒラメマクロファージのCu,Zn-SOD mRNA量の増減は見られなかった。また、Mn-SOD mRNAは強毒株で一過性の増加が見られた。一方、弱毒株の場合、Mn-SOD mRNAは経時的に増加傾向を示した。以上の結果より、Mn-SOD mRNAの誘導は、E.tarda暴露に伴うマクロファージのROS産生と密接に関連する可能性が示唆された。
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