2010 Fiscal Year Annual Research Report
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22590117
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
椛島 力 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 准教授 (20274673)
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| Keywords | HIV / アプタマー / プロテアーゼ / 阻害剤 / 薬剤耐性 / 変異 / ウイルス / 感染症 |
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| Research Abstract |
HIV感染症の治療薬として、ウイルス酵素を標的にした阻害剤が開発され、臨床現場では、これらを組み合わせた多剤併用療法が行われている。しかし、HIVゲノムは変異を起こしやすいため、別の観点からの治療薬開発が求められている。このような新規の治療薬を開発するために、標的酵素であるHIVプロテアーゼ(HIV-PR)のクローニングと精製を行なった。HIV-PR遺伝子をPCRによりクローニングし、発現ベクターに組み込んだ後、大腸菌を形質転換した。このとき、発現酵素の精製を容易にするために、HIV-PRをマルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質(MBP-HIV-PR)として発現するようにした。その結果、HIV-PR遺伝子を組み込んだ大腸菌において、MBP-HIV-PRと推定される大きさのタンパク質が発現した。この形質転換体を大量培養後、アミロース樹脂によるアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製を行なったところ、ほぼ単一にMBP-HIV-PRを精製することができた。このMBP-HIV-PRを用いて、酵素学的性質を調べたところ、プロテアーゼ活性を示し、この活性は、リトナビル(HIV感染治療薬)によって特異的に阻害された。また、抗HIV-PR抗体によって認識されたことから、今回作製したHIV-PRは、野生型の酵素と同様の性質を保持していることが確認できた。
次に、MBP-HIV-PRからMBPを取り除くために、Factor Xaを用いた酵素分解を行なった。その結果、SDS-PAGEにおいて、HIV-PRとMBPを分離することができた。現在、HPLCを用いて、HIV-PRの単離を行なっている。
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