血管平滑筋の形質変換における電位依存性カルシウムチャネルの役割

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22590210
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 砂川 昌範 琉球大学, 医学部, 講師 (70325835)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松下 正之 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30273965) ; 中村 真理子 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40180400)
• Project Period (FY): 2010-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 形質変換 / Ca2+チャネル / 血管平滑筋細胞 / 細胞増殖

Outline of Annual Research Achievements

細胞周期進行には細胞外からのCa2+流入が不可欠である。血管平滑筋の形質変換誘導、すなわち細胞周期進行を決定するうえで電位依存性Ca2+チャネルを介するCa2+流入が重要である。また、Ca2+流入量の時間的空間的変化を決定するのはCa2+チャネルのスプライスバリアントの種類とその発現割合であると予想される。平成25年度では、１ 血管平滑筋の形質変換における電位依存性Ca2+チャネルの役割、２ 形質変換に伴うスプライスバリアントの発現様式の変化、３ 各バリアントの電気生理学的特徴およびプロテインキナーゼによる調節作用の有無を検証することを目的とした。
結果：1 血管平滑筋の形質変換における電位依存性Ca2+チャネルのβサブユニットの関与を調べるために、テトラサイクリン刺激によるβサブユニット遺伝子発現誘導可能なFlp-in-T-REx293細胞（ヒト胎児由来腎臓上皮細胞）を樹立した。テトラサイクリン不含の牛胎児血清下で継代培養を3回繰り返した後、テトラサイクリン添加と無添加の細胞を24時間培養した。Western blot法にてβサブユニット蛋白の発現の有無を確認できた発現OFF状態の細胞と発現ON状態の細胞より全RNAを抽出し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。その結果、細胞内カルシウムの動態に関与する35種類の遺伝子発現が著明に上昇していた。一方でドパミンβハイドロキシラーゼ遺伝子の著明な減少がみられた。2 収縮型および合成型の血管平滑筋細胞よりRNAを抽出し、CaV1.2/CaV3.2の特異的3’UTR配列を含むオリゴdTプライマーによりcDNAライブラリープラスミドを用いて作製を試みたが解析に使用できるライブラリーの作成に至らなかった。3 バリアントcDNAの作成が出来ず、チャネル発現細胞を用いた電気生理学的なカルシウム電流の測定が出来なかった。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。