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2011 Fiscal Year Annual Research Report

K+チャネルの分解による発現量制御

Research Project

Project/Area Number 22590218
Research InstitutionKansai Medical University

Principal Investigator

岡田 誠剛  関西医科大学, 医学部, 講師 (40334677)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 松田 博子  関西医科大学, 医学部, 教授 (10181736)
KeywordsK+チャネル / 分解 / 蛍光タンパク
Research Abstract

前年度までに、神経細胞やHEK293細胞で、内向き整流性K+チャネル(Kir2.1)の発現が過剰になると、同タンパク分解の亢進を示唆するデータを得た。この分解調節を検討するため、他タンパクや、in vivoに応用可能な、2つの方法を開発した。特異的な蛍光色素でパルス・チェイス実験が可能なSNAP-tag、及び、蛍光がゆっくり緑→赤に変わる蛍光タイマー(FT)とKirの融合タンパクを、293T細胞に発現させ、SNAPはパルス・チェイスで、FTは蛍光の緑/赤比を指標にして、分解速度の変化を検出できることを明らかにし、Kir2.1の過剰発現による分解の亢進を明らかにしてきてた。平成23年度は、過剰発現による分解亢進が、電流量の増加によって引き起こされことを、野生型と比較して外向き電流が大きいKir2.1の変異体E224Gを用いて検討し、分解速度が野生型より速いことから、タンパク量ではなく、電流量に依存して分解亢進がおこると結論した。また細胞あたりのSNAP蛍光の減少が、細胞分裂によるものではないことを、電気泳動および蛍光イメージングで確認した。次に、in situ、及びin vivoでタンパク分解速度の変化を検出するために、SNAP-Kir2.1、FT-Kir2.1を発現するウイルスベクターを作製した。これらのウイルスベクターを、海馬スライス培養、幼若ラット海馬に注入し、蛍光観察した。しかし、発現レベルがin vitroと比較して低いこと、(恐らくFTドメインの重合のために惹起された)細胞毒性のため、十分な検討が困難であった。そこで今年度は、内在性の発現量が多く、大量の発現が期待されるCaMKIIと、重合せずに単体で蛍光を発するmonomeric-FTとの融合タンパク発現ウイルスベクターを作製し、in vivoでのタンパク分解の検討を継続する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

情実の通り、ウイルスベクターでは、発現レベルが低い、毒性が認められたことから、計画より、やや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

in situ、in vivoでの発現を成功させるために、発現ベクターの変更、Kir2.1以外のタンパクと蛍光タンパクを融合させることを試みる。

  • Research Products

    (2 results)

All 2011

All Presentation (2 results)

  • [Presentation] レトロウイルス及びレンチウイルスベクターを用いたソマトトロフのin vivoタギング2011

    • Author(s)
      岡田誠剛、松田博子、置村康彦
    • Organizer
      生化学会近畿
    • Place of Presentation
      岡山県倉敷市(せとうち児島ホテル)
    • Year and Date
      2011-08-25
  • [Presentation] 内向き整流性K+チャネルを発現するレンチウイルスベクターのタイターは調製時のチャネル遮断で上昇する2011

    • Author(s)
      岡田誠剛、松田博子
    • Organizer
      第58回日本生化学会近畿支部例会
    • Place of Presentation
      大阪府守口市(関西医科大学)
    • Year and Date
      2011-05-21

URL: 

Published: 2013-06-26  

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