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2010 Fiscal Year Annual Research Report

コレラ菌によるNLRP3活性化新規経路の解析

Research Project

Project/Area Number 22590396
Research InstitutionUniversity of the Ryukyus

Principal Investigator

仲宗根 昇  琉球大学, 医学研究科, 助教 (80175497)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 小倉 裕範  琉球大学, 医学研究科, 助教 (60304557)
Keywordsコレラ菌 / ヘモリジン / NLRP3 / MyD88/Trif
Research Abstract

本研究の目的はコレラ菌培養上清中にあるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化する因子を同定し、その活性化機構を解明することにある。実験計画に従い、C57BL/6マウス由来骨髄マクロファージ(WT-Mφ)及び、MyD88/Trifダブルノックアウトマウス由来骨髄マクロファージ(DKO-Mφ)にリピートトキシンRtxA欠損変異株(ΔrtxA),ヘモリジンHlyA欠損変異株(ΔhlyA)単独あるいはRtxA/HlyAダブル欠損変異株(ΔDMと略)の培養上清を反応させ、IL-1β、IL-18、Caspase1の産生をウエスタンブロット法で調べた。その結果、WT-Mφに対しΔrtxAの培養上清は各因子を産生したが、ΔhlyAとΔDMの培養上清はどの因子も産生しなかった。これに組換hlyAを添加したところどの因子も産生された。このことはIL-1β、IL-18、Caspase1の産生にはRtxAよりHlyAのほうが重要であることを示している。次にDKO-Mφに対する反応を調べて見ると、WT-Mφと同じ結果を示したが、ΔDM培養上清にATPを加えてもIL-18の産生は見られなかった。このことは、HlyAはMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化し、その活性化経路はATPの添加によるP2X7の経路を利用していないことを示唆している。この活性がHlyAのpore forming活性によるものかを調べるため、組換hlyAを100℃、10分の加熱で不活化し同様の実験をしたところ、IL-18の産生は見られなくなった。このことはHlyAによるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化するには、HlyAが活性化できる状態が必要であると思われたが、今回使用した組換HlyAはHis-tag HlyAであり、常法通りNi-アフィニティーカラムで精製したが、わずかに他の蛋白の混入がみられ純品にはいたってない。現在組換HlyA粗製品をイオン交換カラム、ゲル濾過カラム、疎水性過アラムなどにかけ、さらなる純化を試みている。また、他の細菌が産生するpore forming toxinも同様に作用するのかをみるため、現在黄色ブドウ球菌α溶血毒、肺炎球菌溶血毒Pneumolysin、リステリア菌Listeriolysin Oなどの精製を試みている。

  • Research Products

    (4 results)

All 2011 2010 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Detergents enhance EspB secretion from Escherichia coil strains harboring the locus for the enterocyte eiacement (LEE) gene2011

    • Author(s)
      Nakasone N
    • Journal Title

      FEMS microbiol lett

      Volume: 315 Pages: 109-114

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Pathogenic Vibrio activate NLRP3 inflammasome via cytotoxins and TLR/Nucleotide-binding Oligomerization Domain-mediated NF-κB signaling.2010

    • Author(s)
      Toma C
    • Journal Title

      J Immunol

      Volume: 184 Pages: 5287-5297

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Vibrio vulnificus NF-κB活性化因子の解析2010

    • Author(s)
      仲宗根昇
    • Organizer
      日本細菌学会
    • Place of Presentation
      官崎市ホテルメリージュ
    • Year and Date
      2010-09-03
  • [Remarks]

    • URL

      http://w3.u-ryukyu.ac.jp/bacteriology/

URL: 

Published: 2012-07-19  

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