薬物輸送通路の解明-トランスポーターとギャップ結合の関連-

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22590508
• Research Institution: Hyogo University of Health Sciences
• Principal Investigator: 三浦 大作 兵庫医療大学, 薬学部, 助教 (60510873)
• Keywords: トランスポーター / ギャップ結合 / 細胞・組織 / 薬物輸送 / 蛋白質相互作用 / コネキシン / 腎尿細管

Research Abstract

膜タンパクによる物質輸送は、生体恒常性維持の基本的なメカニズムであると考えられている。本研究では、組織中の物質輸送の通路である「薬物トランスポーター」と「ギャップ結合による細胞間連絡」との関連を明らかにすることにより、物質の組織内移動機構、生体恒常性維持機構および病態の解明を目的としている。
平成23年度においても、薬物トランスポーターが多く発現していることがわかっている腎臓に焦点を当て、相互作用すると予想されるトランスポーターとギャップ結合タンパクであるコネキシン(Cx)の組み合わせをプロテオミクスの手法で見いだすことを目標として研究を行った。具体的には、ヒト正常腎尿細管由来のHK-2細胞株を用い、HK-2で内因性に発現しているGJA1、GJB2およびGJC1と、遺伝子導入により強制的に発現させたSLC22A6およびSLC22A8との相互作用を免疫共沈降法により調べたが、相互作用している結果は得られていない。研究の進捗を改善するため、HK-2細胞株よりも増殖が早いヒト胎児腎由来HEK293細胞株を用いることとし、Cx遺伝子20種類全てについて、RT-PCRを行った。その結果、HEK293細胞においては、GJA1、GJA9、GJB2およびGJC1のmRNAを発現していることがわかった。また、作製した発現ベクターコンストラクトを用いて、SLC22A6およびSLC22A8を安定発現させたHEK293細胞を作製した。現在は、SLC22A6もしくはSLC22A8とコネキシンの相互作用の組み合わせを免疫共沈降法により調査している。実際の生体においては、腎尿細管にはSLC22ファミリーを始めとして多くのSLCトランスポーターが発現していることが知られていることから、薬物の輸送通路としてのトランスポーターとギャップ結合の相互作用を調査することは重要であると考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、より正常細胞に近い特性を持つHK-2細胞を用いて研究を行っていたが、細胞増殖が遅く、遺伝子を強制発現させた細胞を作製するのに非常に時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

今後は、HK-2細胞からより増殖が早いHEK293細胞に変更し、遺伝子導入からタンパク抽出までの過程を短縮する。また、免疫共沈降法において、細胞骨格であるアクチンを介したトランスポーターとコネキシンの相互作用についても検討する。