2010 Fiscal Year Annual Research Report
血中sCLEC-2測定法の確立と臨床応用に向けた検討:動脈血栓症の予防を目指して
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22590520
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
長田 誠 山梨大学, 医学部・附属病院, 臨床検査技師 (20569628)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 克枝 山梨大学, 医学工学総合研究部, 准教授 (10324211)
井上 修 山梨大学, 医学工学総合研究部, 助教 (00432154)
尾崎 由基男 山梨大学, 医学工学総合研究部, 助教 (30134539)
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| Keywords | sCLEC-2 / 動脈血栓症 / 血小板 |
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| Research Abstract |
生体内での血小板活性化を知る血液検査は、動脈血栓症準備状態の検出に有用である。我々は、血小板が活性化を受けるとCLEC-2が血小板から遊離するというデータを得ており、血中soluble CLEC-2が生体内で血小板活性化を示すマーカーとなり、心筋梗塞や脳梗塞などの動脈血栓症の発症を予測する検査として利用できると考えられることから、ELISAによる測定系を構築すると共に臨床応用に向けた検討を行った。
抗ヒトCLEC-2抗体を用いたELISA法の開発は、human CLEC-2-rabbit IgG Fcのリコンビナントキメラ蛋白を細胞外に分泌するようにIL2のシグナルベプチドを結合させたプラスミドをCOS7細胞にtransient transfectionし、精製、マウスへの免疫、抗体価チェック、細胞融合、クローニングにて抗ヒトCLEC-2抗体を作製後,血中soluble CLEC-2測定キットを構築した。
soluble CLEC-2発生のメカニズムは二通りあり、一つは蛋白そのものがメタロプロテアーゼにより分解される場合、もう一つは膜の一部が千切れてできるマイクロパーティクル上に乗る形でCLEC-2が遊離する場合である。洗浄血小板をトロンビンで刺激した活性化血小板上清をウエスタンブロットしたところ、CLEC-2が認められた。活性化血小板上清を超遠心した結果,ペレットと上清にCLEC-2が認められたことから、soluble CLEC-2発生のメカニズムは、蛋白の分解とマイクロパーティクルの両方が存在することが明らかとなった。
CLEC-2を分解する酵素については,特異的インヒビター実験において,抑止効果が認められなかったことから,今後の課題とする。
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