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2011 Fiscal Year Annual Research Report

ATPプローブを用いた膵島、骨格筋、心筋細胞内ATP濃度リアルタイムモニタリング

Research Project

Project/Area Number 22590977
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

長嶋 一昭  京都大学, 医学研究科, 講師 (40324628)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 今村 博臣  京都大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (20422545)
KeywordsATP / K_<ATP>チャネル / 糖代謝
Research Abstract

本申請研究は、細胞内ATP濃度を実測可能なKd値を有するATPプローブを作成し、膵β細胞など血糖値恒常性維持に重要な細胞に焦点を絞り、生理的条件下ならびに糖尿病状態での細胞内ATP濃度動態の実際を把握することと、更には上記条件下でのATP濃度変化により活性調節され、特にインスリン分泌に必須であるK_<ATP>チャネルの生理的役割の妥当性を検証することを主たる目的としている。本年度の研究は平成23年度交付申請研究実施計画に沿って進められ、研究成果は以下の通りである。
1)過去に作成済みの蛍光ATPプローブ(2種類)を基に膵β細胞で利用可能なより高いKd値を有する新規ATPプローブを作成し、膵β細胞株MIN6細胞およびマウス膵β細胞にリポフェクション法で導入し細胞内ATP濃度を直接測定した。
2)MIN6細胞に新規ATPプローブおよびFura2AMを導入し、各々、一波長励起二波長測光および二波長励起一波長測光を連続して行うことにより、単一生細胞における細胞内ATPおよび細胞内Ca^<2+>濃度変化の経時的同時測定を行った。
3)蛍光ATPプローブをMIN6細胞に導入し、グルコース反応性を有する細胞を選別し、ATeam導入stable細胞株(MIN6-ATeam)を複数系統確立した。
4)ATeam遺伝子導入(Tg)マウス作成し、得られた5系統のうち単離膵β細胞でのATeam発現およびグルコース反応性が良好な系統を3系統に絞込み、F3マウスまで計30匹以上のTgマウスを得た。最も反応性良好な系統を用いて膵島単離、膵島細胞分散、膵β細胞を初代培養し、生理的条件下での細胞内ATP濃度および細胞内Ca^<2+>濃度の経時的同時測定を行った。また、電気生理学的手法(パッチクランプ法)により、Tgマウス単離膵β細胞から、直接、K_<ATP>チャネル電流を経時的に測定した。
5)糖尿病状態での細胞内ATP濃度動態を解析するため、ATeam遺伝子導入マウスと糖尿病モデルマウスob/obマウスを交配し、膵β細胞内ATP濃度を生細胞のまま経時的に実測可能な糖尿病モデルマウスを作成中である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

新規ATPプローブによる膵β細胞株を用いた細胞内ATP濃度および細胞内Ca^<2+>濃度測定も達成し、より生理的条件下での検証実験に極めて有用なATeam遺伝子導入マウスを作成、得られた系統全ての単離膵β細胞での細胞内ATP濃度測定を実施し、非常に安定かつグルコース刺激に対する反応性が良好な系統を絞り込め、最も良好な系統の個体数を増やすことができており、その系統のマウスの単離膵β細胞の初代培養で、既に細胞内ATP濃度および細胞内Ca^<2+>濃度の同時測定も施行しており、さらにパッチクランプ法にて同細胞のK_<ATP>チャネル電流も確認できている。さらにATeam遺伝子導入マウスと糖尿病モデルマウスとの交配も進めており、当初の予定より進展がみられるため。

Strategy for Future Research Activity

今後も、ATeam遺伝子導入マウスを用いて、多角的に細胞内ATP濃度動態、イオン濃度動態およびイオンチャネル電流を並列測定することにより、特にインスリン分泌に必須であるK_<ATP>チャネルの生理的条件下での役割の妥当性の検証を進めていく。さらに糖尿病状態での上記動態の変化を解析し、病態との関連について検討していく。

  • Research Products

    (28 results)

All 2012 2011

All Journal Article (11 results) (of which Peer Reviewed: 7 results) Presentation (12 results) Book (5 results)

  • [Journal Article] Expression of ATP sensor protein in Caenorhabditis elegans2012

    • Author(s)
      Kishikawa J, Fujikawa M, Imamura H, Yasuda K, Noji H, Ishii N, Mitani S, Yokoyama K
    • Journal Title

      Microsc.Res. Tech

      Volume: 75 Pages: 15-19

    • DOI

      doi:10.1002/jemt.21103

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Visualization and Measurement of ATP Levels in Living Cells Replicating Hepatitis C Virus Genome RNA2012

    • Author(s)
      Ando T., et al
    • Journal Title

      PLoS Pathogens

      Volume: 8 Pages: e1002561

    • DOI

      10.1371/journal.ppat.1002561

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 新生児糖尿病2012

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Journal Title

      International Review of Diabetes

      Volume: (印刷中)

  • [Journal Article] GCKR mutations in Japanese families with clustered type 2 diabetes2011

    • Author(s)
      Tanaka D, Nagashima K, Sasaki M, Yamada C, Funakoshi S, Akitomo K, Takenaka K, Harada K, Koizumi A, M, Inagaki N
    • Journal Title

      Mol. Genet. Metab

      Volume: 102 Pages: 453-460

    • DOI

      doi:10.1016/j.ymgme.2010.12.009

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Quantitative Glucose and ATP Sensing in Mammalian Cells2011

    • Author(s)
      Liemburg-Apers DC, Imamura H, Forkink M, Nooteboom M, Swarts HG, Brock R, Smeitink JA, Willems PH, Koopman WJ
    • Journal Title

      Pharm. Res

      Volume: 8 Pages: 2745-2757

    • DOI

      doi:10.1007/s11095-011-0492-8

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Utility of indices using C peptide levels for indication of insulin therapy to achieve good glycemic control in Japanese patients with type 2 diabetes2011

    • Author(s)
      Funakoshi S, et al
    • Journal Title

      J Diabetes Invest

      Volume: 2 Pages: 297-303

    • DOI

      10.1111/j.2040-1124.2010.00096.x

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at single cell level2011

    • Author(s)
      Nakano M, et al
    • Journal Title

      ACS Chemical Biology

      Volume: 6 Pages: 709-715

    • DOI

      10.1021/cb100313n

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1 (LETM1) and uncoupling proteins- 2 and 3 (UCP2/3) contribute to two distinct mitochondrial Ca2+ uptake pathways2011

    • Author(s)
      Waldeck-Weiermair, M., et al
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 286 Pages: 28444-28455

    • DOI

      10.1074/jbc.M111.244517

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 糖尿病とイオンチャネル2011

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Journal Title

      細胞

      Pages: 420-423

  • [Journal Article] 新生児糖尿病2011

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Journal Title

      月刊糖尿病

      Pages: 58-64

  • [Journal Article] その他の特定の機序、疾患による糖尿病2011

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Journal Title

      内分泌・糖尿病・代謝内科

      Pages: 44-52

  • [Presentation] Simultaneous ATP and Ca^<2+> imaging of a single insulin-secreting islet cell2012

    • Author(s)
      Tanaka T., et al
    • Organizer
      The 10th NTU-Japan International mini-symposium on Molecular and Cell Biology
    • Place of Presentation
      国立台湾大学
    • Year and Date
      2012-01-08
  • [Presentation] 飢餓条件下におけるVCPタンパク質の機能解析2011

    • Author(s)
      小池雅昭, 他
    • Organizer
      第37回日本生体エネルギー研究会
    • Place of Presentation
      京都産業大学
    • Year and Date
      20111220-20111222
  • [Presentation] Pannexin1は細胞内ATPレベルを制御することでアポトーシスの進行に重要な役割を果たす2011

    • Author(s)
      坂本修一朗, 他
    • Organizer
      第37回日本生体エネルギー研究会
    • Place of Presentation
      京都産業大学
    • Year and Date
      20111220-20111222
  • [Presentation] ATPバイオセンサーを用いた膵島β細胞のライブイメージング2011

    • Author(s)
      田中喬, 他
    • Organizer
      第37回日本生体エネルギー研究会
    • Place of Presentation
      京都産業大学
    • Year and Date
      20111220-20111222
  • [Presentation] 飢餓条件下におけるVCPタンパク質の機能解析2011

    • Author(s)
      小池雅昭, 他
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      20110921-20110924
  • [Presentation] ミトコンドリアATP濃度は細胞質ATP濃度とは半独立に制御されている2011

    • Author(s)
      今村博臣, 他
    • Organizer
      第84回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      20110921-20110924
  • [Presentation] Functional analysis of KCNJ11 mutation in neonatal diabetes2011

    • Author(s)
      Nagashima K, et al
    • Organizer
      3th Asian Association for the study of Diabetes
    • Place of Presentation
      北京(中国)
    • Year and Date
      20110722-20110724
  • [Presentation] Pedigree analysis of a highly aggregated Japanese families with diabetes mellitus2011

    • Author(s)
      Tanaka D, et al
    • Organizer
      American Diabetes Association, 71st Scientilic Sessions
    • Place of Presentation
      San Diego (米国)
    • Year and Date
      20110624-20110628
  • [Presentation] 本邦における新生児糖尿病発症頻度および発症原因遺伝子に関する検討2011

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Organizer
      第54回日本糖尿病学会総会
    • Place of Presentation
      札幌
    • Year and Date
      20110519-20110521
  • [Presentation] 日本人糖尿病多発家系を用いた全ゲノム連鎖解析と疾患感受性遺伝子の同定2011

    • Author(s)
      田中大祐, 他
    • Organizer
      第54回日本糖尿病学会総会
    • Place of Presentation
      札幌
    • Year and Date
      20110519-20110521
  • [Presentation] Distribution and dynamics of ATP level inside living cells2011

    • Author(s)
      Hiromi Imamura
    • Organizer
      1st NIBB-Princeton Symposium
    • Place of Presentation
      岡崎コンファレンスセンター
    • Year and Date
      2011-11-01
  • [Presentation] ATP結合タンパク質を利用した細胞内ATPの可視化2011

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      酵素工学研究会第65回公演会
    • Place of Presentation
      京都テルサ
    • Year and Date
      2011-04-22
  • [Book] 経口糖尿病治療薬の新展開-病態プロファイルと最適薬剤選択の決め手2012

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Publisher
      フジメディカル出版(印刷中)
  • [Book] 最新臨床糖尿病学(上)2012

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Publisher
      日本臨床社(印刷中)
  • [Book] 最新臨床糖尿病学(下)2012

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Publisher
      日本臨床社(印刷中)
  • [Book] 糖尿病治療薬のサイエンス2012

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Publisher
      南山堂(印刷中)
  • [Book] 糖尿病学イラストレイテッド2012

    • Author(s)
      長嶋一昭, 他
    • Total Pages
      6
    • Publisher
      羊土社

URL: 

Published: 2013-06-26  

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