In vivo cross-link法による治療抵抗性うつ病関連蛋白質の検索

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22591259
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 大城 将也 浜松医科大学, 医学部, 特任研究員 (40567880)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 和彦 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (80263911) ; 松崎 秀夫 浜松医科大学, 子どものこころの発達研究センター, 准教授 (00334970) ; 鈴木 勝昭 浜松医科大学, 子どものこころの発達研究センター, 准教授 (00285040) ; 岩田 圭子 浜松医科大学, 子どものこころの発達研究センター, 助教 (30415088) ; 立花 太郎 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (80311752)
• Keywords: うつ病 / セロトニン・トランスポーター / 治療抵抗性 / 中枢神経系 / In vivo cross-link法

Research Abstract

本研究計画はTime-controlled transcardiac perfusion cross-linking法(tcTPC法:通称In vivo cross-link法)によりSSRIの脳内セロトニン・トランスポーターへの作用を阻害する原因タンパク質分子を検索し、治療抵抗性うつ病の病態解明を目指すものである。
In vivo cross-link法による候補分子検索を行っている。セロトニン・トランスポーター(SERT)に対応する力価の高いモノクローナル抗体を再作製し、昨年度終盤に至って得られた抗体を大量生産した。これを用いて、潅流固定後のマウス脳ホモジネートからSERT特異的な抗体による免疫沈降を行い、得られた複合体を質量分析装置により分析したところ、サンプル中にSERTを含め85種類のタンパク質が同定された。しかし、予備実験結果の段階で見出されたNSF (N-ethylmaleimidesensitive factor)およびsyntaxin 1Aはこの中に入っていなかった。今回得られたモノクローナル抗体のエピトープはN末端であるため、N末端に結合するNSFおよびsyntaxin 1Aは、この方法では得られない可能性が考えられた。次にHEK293細胞によりセロトニン・トランスポーターとNSFを共発現させた培養細胞系を作製して、NSFを阻害するRNAiを投与したところ、細胞内へのセロトニンの再取り込みが減少し、SERTの機能を抑制することが示唆された。
今年度は85種類のタンパク質のSERTとの結合をそれぞれ再確認し、培養細胞系を用いたタンパク質機能の精査を行う。また、すでに結合が判明しているNSFの機能評価をIn cell ELISAなどで進め、治療抵抗性うつ病等疾患サンプルでのSERTの機能との関連を調べる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実験の進行のために有用なセロトニン神経細胞株が入手できなくなり、方針の変更を余儀なくされたため

Strategy for Future Research Activity

セロトニン神経細胞株の代わりに、HEK 293細胞にSERT遺伝子を導入したものを使って、取り込み実験に供することが可能になったので、今年度はこの細胞を用いて実験を進める。セロトニン・トランスポーターに対応する力価の高いモノクローナル抗体は十分な質と量が得られた。