2012 Fiscal Year Annual Research Report
ＦＩＲＳの診断と治療への応用を目的としたフリー・アクチビン測定法の開発
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22591816
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
安部 由美子 群馬大学, 保健学研究科, 准教授 (70261857)
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| Project Period (FY) |
2010-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | アクチビン / フォリスタチン / 羊膜細胞 / 絨毛膜羊膜炎 / FIRS |
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| Research Abstract |
FIRSを惹起する基礎疾患として絨毛膜羊膜炎が知られており、Blanc分類3期では炎症が羊膜まで及ぶ。無血管性の組織である羊膜を構成する細胞の一つである羊膜上皮細胞は、卵膜の最内層に位置し、羊水と直接接し、羊膜上皮細胞で産生・分泌される増殖因子は胎児に影響すると考えられるため、羊膜上皮細胞培養系を用いてactivin Aの産生・分泌を検討し、1) 羊膜上皮細胞が細胞密度に依存してactivin A蛋白を産生・分泌すること、2)培養時間に依存してactivin A蛋白の産生・分泌は増加し、TNF-α(10 ng/ml)はactivin A蛋白の産生・分泌を促進させること、また、3) TNF-α(10 ng/ml)は羊膜上皮細胞の増殖を抑制することを明らかにした（Abe Y. et al. J Endocrinol Invest. 2013, in press）。更に、グラム陰性菌体成分のlipopolysaccharideにも羊膜上皮細胞のactivin A産生・分泌刺激作用があることを明らかにした（Abe Y. et al.投稿中）。また、昨年度の研究により、羊膜培養細胞では、TNF-αによりinhibin/activin βA subunitの発現が増加するのに対してinhibin α-subunit、follistatin、FSTL-3の発現はわずかな増加しか認められないことより、この系では、TNF-α刺激によりfree activin Aが増加することが予想されたため、TNF-α刺激下の羊膜培養細胞上清をfree activin A測定検討用サンプルとしてストックした。更に、現有の抗体以外に、新たに、free activin Aの認識に優れたペプチド抗体の作製を開始し、また、種差が少ないbovine activin Aを用いた抗体作製の準備を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アッセイ法の開発はやや遅れているが、TNF-α刺激によりfree activin Aを増加させることが予想される羊膜培養細胞上清をfree activin A測定検討用サンプルとしてストックを作製したこと、現有の抗体以外に、新たに、free activin Aの認識に優れたペプチド抗体の作製を開始したこと、種差が少ないbovine activin Aを用いた抗体作製の準備を開始したこと、また、絨毛膜羊膜炎モデルとしての羊膜細胞培養系で炎症性サイトカインTNF-αによるactivin A産生・分泌の増加を明らかにし論文として発表したこと、グラム陰性菌体成分であるlipopolysaccharideが羊膜上皮細胞培養系でactivin A産生・分泌を刺激することを明らかにし論文投稿中であることより、上記と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
作製中のペプチド抗体が得られたら直ちに、この抗体とactivin A及びfollistatinを用いて、この抗体が, free activin Aを特異的に認識することを確認し、ELISAを開発する。ELISAでは、まず、平成24年度に保存した、free activin Aの濃度が高く、血清に比べnonspecific bindingが低いと考えられる、TNF-α刺激下羊膜培養細胞の上清（10% FBS含有）をサンプルとして用いて検討する。羊膜培養細胞上清中free activin A の測定が可能であれば、ヒト血清中のfree activin A の測定を検討する。ペプチド抗体の特異性が低い場合や力価が低い場合はbovine activin Aを用いた抗体作製も検討する。また、follistatinはactivin に比べてheparan sulfateへの吸着が強いことを利用し、affinity chromatographyにより、activin-follistatin complexとfollistatinを樹脂に吸着させ、path throughの溶出されるfree activin Aを測定することも同時に行う。更に、Blanc分類3期絨毛膜羊膜炎モデルである炎症性サイトカイン刺激下の羊膜培養細胞で、activin A産生・分泌について継続して検討する。
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